什么是熒光標記
熒光標記（Fluorescent labeling）是一種廣泛應(yīng)用于生命科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)，用于追蹤和定位目標生物分子的代謝和運動軌跡。通過將熒光染料與目標分子特異性地結(jié)合，熒光標記使得目標分子在顯微鏡下呈現(xiàn)出明亮的熒光信號，從而實現(xiàn)對生物過程的實時觀察與定量分析。
熒光標記所依賴的化合物稱為熒光物質(zhì)。熒光物質(zhì)是指具有共軛雙鍵體系化學(xué)結(jié)構(gòu)的化合物，受到紫外光或藍紫光照射時，可激發(fā)成為激發(fā)態(tài)，當從激發(fā)態(tài)恢復(fù)基態(tài)時，發(fā)出熒光。利用熒光標記分子，將其共價結(jié)合在一些分子識別物質(zhì)（比如酶、抗原/抗體、DNA、適配體、多肽等）上作為探針，分子識別物質(zhì)與被檢測的對象（比如蛋白、多肽等）進行反應(yīng)之后，根據(jù)熒光標記分子在反應(yīng)前后的熒光強度變化，對被檢測對象進行各種定量的分析。
熒光標記優(yōu)點
1、熒光標記的無放射物污染，操作簡便
2、高靈敏度和空間分辨率
3、可視化等
這些優(yōu)點，使得熒光標記物在許多研究領(lǐng)域的應(yīng)用日趨廣泛。
常見的熒光染料
1、香豆素系列：
香豆素和香豆素衍生物是紫外線可激發(fā)的藍色熒光染料，其發(fā)射波長范圍約為390至480nm。用途最廣泛的香豆素包括AMCA，7-氨基香豆素(AFC和AMC)，7-羥基香豆素和7-甲氧基香豆素的衍生物。
香豆素類熒光染料分子量很小，可紫外激發(fā)，一般發(fā)藍色熒光（emission range ~410 to 470 nm），常常作為多色熒光靶標實驗中藍光染料。由于價格便宜，個頭小，香豆素類染料常常用于標記酶底物，從而可在細胞中，溶液中檢測酶活性
2、羅丹明系列：
羅丹明染料分子的激發(fā)波長通常在500-600nm之間，而發(fā)射波長在550-750nm之間。此外為了更適應(yīng)生物熒光成像，可以通過改變其結(jié)構(gòu)和偶聯(lián)元素使其吸收和發(fā)射紅移，進而衍生了一系列近紅外羅丹明染料。羅丹明可以覆蓋從綠色到紅色廣泛的光譜，其中橙色熒光的四甲基羅丹明最常見，最常用。
羅丹明是3′,6’雙胺化的呫噸類（Xanthene）熒光染料。相對于熒光素染料（羥化呫噸），羅丹明（胺化呫噸）的熒光具有更好的pH穩(wěn)定性，并且胺化染料更容易結(jié)構(gòu)多樣化，不同結(jié)構(gòu)會得到不同波長和顏色的熒光，因此羅丹明類染料可選用的熒光顏色更多，很多染料有比熒光素波長更長的熒光，是熒光素的有力補充。利用熒光素和各種羅丹明的組合，可以實現(xiàn)各種多色彩染色，標記，追蹤，常常用于DNA測序，熒光免疫，微陣列的各種生物實驗中。羅丹明特別適合核酸分子標記，也可以用于dextran等高分子的標記。由于大多數(shù)羅丹明水溶性差，標記蛋白時容易產(chǎn)生蛋白聚集，熒光淬滅等問題，需注意或者選擇其它熒光分子。
3、熒光素FITC系列：
FITC系列熒光染料的激發(fā)波長為495nm左右，發(fā)射波長為520nm左右，呈綠色熒光。常用的FITC系列有FITC，5-羧基熒光素，6-羧基熒光素，氨基熒光素等。熒光素(fluorescein)是最早使用，最經(jīng)濟實惠，也是使用最廣泛的熒光染料之一。它的兩種形式FAM (fluorescein amidite)和FITC (fluorescein isothiocyanate)常常見諸于文獻報道中。熒光素有很多優(yōu)點：它量子產(chǎn)率很好，高達到0.94，因此初亮度非常明亮；它的水溶性很好，和蛋白偶聯(lián)不會產(chǎn)生沉淀問題；它的激發(fā)峰是494nm，和常用的激光束488nm(argon-ion laser)很匹配。它的弱點是光穩(wěn)定性欠佳，長時間照射熒光易淬滅，另外它的熒光對pH敏感，在偏酸性條件下熒光變?nèi)酢?/span>
4、CY系列：
Cy系列熒光染料包括Cy3、Cy5、Cy7等，它們的激發(fā)波長和發(fā)射波長略有不同。Cy3的激發(fā)波長為550nm左右，發(fā)射波長為570nm左右;Cy5的激發(fā)波長為650nm左右，發(fā)射波長為670nm左右;Cy7的激發(fā)波長為750nm左右，發(fā)射波長為770nm左右。這些熒光染料常用于熒光免疫分析、熒光探針檢測、熒光染色以及生物熒光標記等領(lǐng)域。Cy系列熒光染料具有優(yōu)異的光學(xué)性質(zhì)和穩(wěn)定性，能夠提供高靈敏度和高特異性的檢測結(jié)果，因此在生物醫(yī)學(xué)研究中得到了廣泛應(yīng)用。Cy(Cyanine)是一系列非常常用的熒光化合物。它們熒光比FITC，羅丹明等更亮更穩(wěn)定，在工業(yè)和生物技術(shù)中已有很多年的使用歷史?；诓煌幕瘜W(xué)結(jié)構(gòu)，Cy染料的熒光可以覆蓋從紫外到近紅外幾乎所有光譜。
a、Cy2是一種發(fā)射綠色熒光的染料，光學(xué)性質(zhì)與羅丹明綠、FITC、AF488類似
b、Cy3 (Cyanine 3) 是一種發(fā)橘黃色熒光的花青素?zé)晒馊玖?/span>
c、Cy5是明亮的紅色熒光染料。由于它的激發(fā)和發(fā)射峰都在長波長紅光區(qū)，而在這個區(qū)域生物樣品的自身熒光較弱，因此，相對于Cy3，Cy5具有明顯的靈敏度優(yōu)勢。
d、Cy7 屬近紅外熒光染料，它發(fā)射的熒光肉眼不可見但是可以被大多數(shù)熒光儀器識別
5、BODIPY系列
BODIPY染料可覆蓋所有的可見光光譜范圍，與各種儀器的參數(shù)都相匹配。 和AF系列，Cy系列染料一樣，硼二吡咯系列染料熒光明亮，消光系數(shù)高，光穩(wěn)定性好。確定是價格昂貴
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