01 熒光光譜儀介紹
1、原理 在吸收紫外和可見電磁輻射的過程中，分子受激躍遷至激發(fā)電子態(tài)，大多數(shù)分子將通過與其它分子的碰撞以熱的方式散發(fā)掉這部分能量，部分分子以光的形式放射出這部分能量，放射光的波長不同于所吸收輻射的波長。后一種過程稱作光致發(fā)光。 分子發(fā)光包括熒光、磷光、化學(xué)發(fā)光、生物發(fā)光和散射光譜等?；诨衔锏臒晒鉁y量而建立起來的分析方法稱為分子熒光光譜法。 被測的熒光物質(zhì)在激發(fā)光照射下所發(fā)出的熒光，經(jīng)過單色器變成單色熒光后照射于光電倍增管上，由其所發(fā)生的光電流經(jīng)過放大器放大輸至記錄儀。一個激發(fā)，一個發(fā)射，采用雙單色器系統(tǒng)，可分別測量激發(fā)光譜和熒光光譜。目前國內(nèi)外熒光光譜儀示意圖如圖一： 2、分類 熒光光譜儀是測定材料發(fā)光性能的基本設(shè)備。通用熒光光譜儀大致可分為3種： 3、主要部件 光源：提供不同波長的激發(fā)光 單色器：激發(fā)單色器將光源發(fā)出的復(fù)色光變成單色光，發(fā)射單色器將發(fā)出的熒光與雜散光分離，防止雜散光對熒光測定產(chǎn)生干擾。 狹縫：控制光通量 檢測器：光電倍增管 樣品池：四面透明正方形石英池，長1cm，寬1cm 4、主要用途 （1）熒光激發(fā)光譜和熒光發(fā)射光譜 熒光光譜的應(yīng)用領(lǐng)域： 02 熒光與磷光 1、熒光與磷光現(xiàn)象 2、熒光與磷光產(chǎn)生原理 熒光：第一激發(fā)單重態(tài)的最低振動能級→基態(tài) 磷光：第一激發(fā)三重態(tài)的最低振動能級→基態(tài) 3、激發(fā)與發(fā)射光譜 任何熒光化合物都具有兩個特征光譜：激發(fā)光譜和發(fā)射光譜。 激發(fā)光譜反映了某一固定的發(fā)射波長下所測量的熒光強度對激發(fā)波長的依賴關(guān)系； 發(fā)射光譜反映了某一固定激發(fā)波長下所測量的熒光的波長分布。 激發(fā)光譜和熒(磷)光光譜 熒光光譜能夠提供激發(fā)譜、發(fā)射譜、峰位、峰強度、量子產(chǎn)率、熒光壽命、熒光偏振度等信息，熒光分析定性和定量的基礎(chǔ)。 熒光光譜的特點： （1）Stokes位移。激發(fā)光譜與發(fā)射光譜之間有波長差，發(fā)射光譜波長比激發(fā)光譜波長長； （2）發(fā)射光譜的形狀與激發(fā)波長無關(guān)； （3）鏡像規(guī)則，熒光發(fā)射光譜與它的吸收光譜成鏡像對稱關(guān)系。 4、熒光壽命 熒光物質(zhì)具有兩個重要的發(fā)光參數(shù)：熒光壽命和熒光量子產(chǎn)率。 熒光壽命（τ）是指當(dāng)激發(fā)停止后，分子的熒光強度降到激發(fā)時最大強度的1/e所需的時間，它表示粒子在激發(fā)態(tài)存在的平均時間，通常稱為激發(fā)態(tài)的熒光壽命。與穩(wěn)態(tài)熒光提供一個平均信號不同，熒光壽命提供的是激發(fā)態(tài)分子的信息，前者可以告訴你事情發(fā)生了，而后者可以告訴你為什么發(fā)生。 熒光壽命示意圖 熒光壽命與物質(zhì)所處微環(huán)境的極性、黏度等有關(guān)，可以通過熒光壽命分析直接了解所研究體系發(fā)生的變化。熒光現(xiàn)象多發(fā)生在納秒級，這正好是分子運動所發(fā)生的的時間尺度，因此利用熒光技術(shù)可以“看”到許多復(fù)雜的分子間作用過程，例如超分子體系中分子間的簇集、固液界面上吸附態(tài)高分子的構(gòu)象重排、蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的變化等。熒光壽命分析在光伏、法醫(yī)分析、生物分子、納米結(jié)構(gòu)、量子點、光敏作用、鑭系元素、光動力治療等領(lǐng)域均有應(yīng)用。 熒光壽命的測定技術(shù)有時間分辨單光計數(shù)技術(shù)(TCSPC)、相調(diào)法、閃頻法。其中TCSPC具有靈敏度高、測定結(jié)果準確、系統(tǒng)誤差小的優(yōu)點，是目前最流行的的熒光壽命測定方法。 5、熒光量子產(chǎn)率 熒光量子產(chǎn)率（φf）是熒光物質(zhì)另一個基本參數(shù)，它表示物質(zhì)發(fā)生熒光的能力，數(shù)值在0~1之間。熒光量子效率是熒光輻射與其他輻射和非輻射躍遷競爭的結(jié)果。 式中， kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)， ∑ki為其他有關(guān)過程的速率常數(shù)總和。一般來說， kf主要決定于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而 ∑ki主要決定于化學(xué)環(huán)境，同時也與化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。 6、分子結(jié)構(gòu)與熒光 并不是所有的分子都能產(chǎn)生熒光，分子產(chǎn)生熒光必須具有：合適的結(jié)構(gòu)和一定的熒光量子產(chǎn)率。 熒光產(chǎn)生與分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系如下： （1）電子躍遷類型。大多數(shù)熒光化合物都是由π→π*或n→π*躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過振動弛豫或其他非輻射躍遷，在發(fā)生π*→π或π*→n躍遷而產(chǎn)生熒光，其中π*→π熒光效率最高。 （2）共軛效應(yīng)。含有π*→π躍遷能級的芳香族化合物的熒光最常見且最強。具有較大共軛體系或脂環(huán)羰基結(jié)構(gòu)的脂肪族化合物也可能產(chǎn)生熒光。 （3）取代基效應(yīng)。苯環(huán)上有吸電子基常常會妨礙熒光的產(chǎn)生，而給電子基會使熒光增強。 （4）平面剛性結(jié)構(gòu)。具有平面剛性結(jié)構(gòu)的有機分子大多具有強烈熒光，因為該結(jié)構(gòu)可降低分子振動，減少與溶劑的相互作用。 03 熒光分析 熒光分析就是基于物質(zhì)的光致發(fā)光現(xiàn)象而產(chǎn)生的熒光的特性及其強度進行物質(zhì)的定性和定量的分析方法。目前，也廣泛地作為一種表征技術(shù)來研究體系的物理、化學(xué)性質(zhì)及其變化情況，例如生物大分子構(gòu)象及性質(zhì)的研究。 熒光光譜適用于固體粉末、晶體、薄膜、液體等樣品的分析。根據(jù)樣品分別選配石英池（液體樣品）或固體樣品架（粉末或片狀樣品）。 熒光分析的優(yōu)點： （1）靈敏度高； （2）選擇性強； （3）試樣量少、方法簡單； （4）提供較多的物理參數(shù)。但是也存在應(yīng)用范圍不夠廣泛、對環(huán)境敏感（干擾因素多）等缺點。 1、定性分析 不同結(jié)構(gòu)熒光化合物都有特征的激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，因此可以將熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜與發(fā)射光譜的形狀、峰位與標準溶液的光譜圖進行比較，從而達到定性分析的目的。 2、定量分析 在低濃度時，溶液的熒光強度與熒光物質(zhì)的濃度成正比：F=Kc。其中，F(xiàn)為熒光強度，c為熒光物質(zhì)濃度，K為比例系數(shù)。這就是熒光光譜定量分析的依據(jù)。 上述關(guān)系不適用于熒光物質(zhì)濃度過高時，熒光物質(zhì)濃度過高，其熒光強度反而降低。原因有： （1）內(nèi)濾效應(yīng)。一是，當(dāng)溶液濃度過高時，溶液中雜質(zhì)對入射光的吸收作用增大，相當(dāng)于降低了激發(fā)光的強度。二是，濃度過高時，入射光被液池前部的熒光物質(zhì)強烈吸收，處于液池中、后部的熒光物質(zhì)，則因受到入射光大大減弱而使熒光強度大大降低；而儀器的探測窗口通常對準液池中部，從而導(dǎo)致檢測到的熒光強度大大降低。 （2）相互作用。較高濃度溶液中，可發(fā)生溶質(zhì)間的相互作用，產(chǎn)生熒光物質(zhì)的激發(fā)態(tài)分子與其基態(tài)分子的二聚物或其他溶質(zhì)分子的復(fù)合物，從而導(dǎo)致熒光光譜的改變和/或熒光強度下降。當(dāng)濃度更大時，甚至?xí)纬蔁晒馕镔|(zhì)的基態(tài)分子聚集體，導(dǎo)致熒光強度更嚴重下降。 （3）自淬滅。熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜與其吸收光譜呈現(xiàn)重疊，便可能發(fā)生所發(fā)射的熒光被部分再吸收的現(xiàn)象，導(dǎo)致熒光強度下降。溶液濃度增大時會促使再吸收現(xiàn)象加劇。 3、影響熒光強度的外部因素
(1) 基本型：在200-800 nm的紫外可見波段的穩(wěn)態(tài)光譜儀。
(2) 擴展型：覆蓋200-1700 nm波段的紫外可見-近紅外穩(wěn)態(tài)光譜儀。
(3) 綜合型：覆蓋上述兩個波段，同時可測瞬態(tài)光譜的光譜儀。
（2）同步熒光（波長和能量）掃描光譜
（3）3D（Ex Em Intensity)
（4）Time Base和CWA(固定波長單點測量）
（5）熒光壽命測量，包括壽命分辨及時間分辨
（6）計算機采集光譜數(shù)據(jù)和處理數(shù)據(jù)（Datamax和Gram32)
