▲第一作者：徐澤菲，姚培圓；通訊作者：朱敦明，吳洽慶
通訊單位：中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所論文DOI：10.1021/acscatal.0c02400手性七元氮雜環(huán)化合物因廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物和藥物的合成而備受關(guān)注，其中手性1,4-二氮?是多種藥物的重要結(jié)構(gòu)單元。本文通過酶庫篩選及蛋白質(zhì)工程獲得了兩個立體選擇性互補的亞胺還原酶，首次通過亞胺還原酶催化分子內(nèi)不對稱還原胺化反應(yīng)實現(xiàn)了手性1,4-二氮?類藥物關(guān)鍵中間體的不對稱合成，并通過密度函數(shù)計算及分子動力學(xué)計算，揭示了突變酶催化活力提高的主要原因是酶與NADPH相互作用的改變，為提高NAD(P)H依賴型氧化還原酶的活力提供了一個新的有效改造策略。失眠是最常見的一種睡眠障礙，在成年人群中發(fā)病率高，超過3億中國人有睡眠障礙。蘇沃雷生是一類新型的催眠藥，2014年獲得美國FDA批準(zhǔn)用于治療難以入睡或維持睡眠的首個食欲素受體拮抗劑。臨床研究表明，對抗抑郁類鎮(zhèn)靜藥和苯二氮?類鎮(zhèn)靜藥產(chǎn)生耐藥性的失眠患者，蘇沃雷生的治療效果良好。蘇沃雷生的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)單元是一個手性1,4-二氮?環(huán)，但其高效不對稱合成仍然是具有挑戰(zhàn)的課題。亞胺還原酶是一類NAD(P)H依賴型的氧化還原酶，可以催化潛手性亞胺不對稱還原生成相應(yīng)的手性胺，是手性胺合成領(lǐng)域極具潛力的一類生物催化劑。本論文首次利用亞胺還原酶催化氨基酮底物的分子內(nèi)還原胺化制備手性1,4-二氮?類化合物。創(chuàng)新發(fā)展生物催化技術(shù)，實現(xiàn)傳統(tǒng)化學(xué)法難以實現(xiàn)或污染嚴(yán)重的反應(yīng)，闡明生物催化劑的手性控制機理，建立相關(guān)藥物及精細(xì)化學(xué)品的綠色合成工藝，促進(jìn)化學(xué)工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展一直是我們研究團隊的目標(biāo)。發(fā)展亞胺還原酶催化不對稱合成手性1,4-二氮?類化合物，不僅可以解決現(xiàn)有藥物的合成難題，也可以為新藥開發(fā)提供新的結(jié)構(gòu)模塊。首先利用蘇沃雷生關(guān)鍵中間體的前體為模式底物，篩選實驗室前期已建立的亞胺還原酶庫，發(fā)現(xiàn)兩個酶表現(xiàn)出互補的立體選擇性，（R）-或（S）-構(gòu)型產(chǎn)物的對映體過量值均大于99%，催化效率分別為0.027 s ?1 mM ?1和0.962 s?1 mM?1。蘇沃雷生中間體為R構(gòu)型，而（R）-選擇性亞胺還原酶的低活力促使我們對其進(jìn)行蛋白質(zhì)工程改造。該酶是生物代謝途徑的喋啶還原酶，已有晶體結(jié)構(gòu)報道。我們將本論文底物對接到酶的活性中心，選擇底物與輔酶周圍25個氨基酸殘基進(jìn)行單點飽和突變，其后再對篩選到的單點突變進(jìn)行簡單組合，獲得了催化效率提高61倍的雙突變體Y194F/D232H（Table 1）。▲Table 1 Kinetics parameters of mutants of IR1 towards 3aa
為揭示突變酶催化活力提高的原因，我們進(jìn)一步與斯德哥爾摩大學(xué)盛翔博士及所內(nèi)李金龍助理研究員合作進(jìn)行計算分析。采用量子化學(xué)團簇方法進(jìn)行密度函數(shù)計算，顯示突變體中氫轉(zhuǎn)移的能量勢壘較野生型降低了 2.7 kcal/mol, 與實驗結(jié)果吻合。通過比較過渡態(tài)的優(yōu)化結(jié)構(gòu)，確定了影響活性提高的一個主要因素是酶與NADPH相互作用的改變，即232位組氨酸殘基的側(cè)鏈與NADPH的酰胺基形成氫鍵，穩(wěn)定了氫化物轉(zhuǎn)移的過渡態(tài)（Figure 1）。利用分子動力學(xué)模擬預(yù)測了酶分子與底物的結(jié)合自由能，整體趨勢和實驗測得的Km值一致。
▲Figure 1. Optimized structures of the transition states for the hydride transfer in WT enzyme and Y194F/D232H mutant.隨后用該突變體進(jìn)行實驗室規(guī)模制備反應(yīng)（100 mL），1.0 g濕菌在10 h能夠轉(zhuǎn)化100 mM 底物獲得蘇沃雷生中間體，產(chǎn)物收率及對映體過量值分別為81%和99%。并利用立體選擇性互補的兩個酶合成了一系列具有不同結(jié)構(gòu)特征的手性1,4-二氮?類化合物 (Table 2)。▲Table 2 Preparative-scale reductive amination for the synthesis of various 1, 4-diazepanes a
我們通過篩選48個亞胺還原酶，實現(xiàn)了酶促分子內(nèi)不對稱還原胺化反應(yīng)構(gòu)建具有生物活性的手性1,4-二氮?類化合物。之后利用蛋白質(zhì)工程改造，成功得到催化效率顯著提高的突變體，在制備規(guī)模反應(yīng)中轉(zhuǎn)化了100 mM底物，為重要藥物中間體的合成提供了一種更綠色經(jīng)濟的方法。計算分析揭示了突變酶催化活力提高的主要原因是酶與NADPH相互作用的改變，為提高NAD(P)H依賴型氧化還原酶的活力提供了一個新的有效改造策略。利用立體選擇性互補的兩個酶合成了一系列具有不同結(jié)構(gòu)特征的手性1,4-二氮?化合物，為該類具有重要生理活性的手性結(jié)構(gòu)模塊的精準(zhǔn)構(gòu)建提供了一種有效的生物催化方法。生物催化是化學(xué)、生物及計算等多學(xué)科交叉的學(xué)科，選擇一類有價值的底物是課題開展的起點，而篩選及改造獲得優(yōu)異性能的酶，能為底物轉(zhuǎn)化提供有力的工具，計算分析則能從分子基礎(chǔ)去解析反應(yīng)本質(zhì)。完成本論文的過程，深刻體會到團隊的重要性，有多學(xué)科科研人員的指導(dǎo)、交流，才能取得一個更完整的研究成果。另外一個體會就是前期工作積累的重要性，構(gòu)建的野生酶庫為獲得目標(biāo)酶提供了基礎(chǔ)，我們的酶庫仍然在不斷積累擴充中，期待未來應(yīng)用到更多類型目標(biāo)產(chǎn)物的生物催化合成工藝中。中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所生物催化與綠色化工研究團隊由朱敦明研究員帶領(lǐng)的生物催化反應(yīng)機理解析及應(yīng)用研究組和由吳洽慶研究員帶領(lǐng)的生物催化劑發(fā)現(xiàn)與改造研究組組成，團隊科研人員16人、博士和碩士研究生12人、博士后2人，其中擁有理學(xué)、工學(xué)博士學(xué)位人員8人，正高級研究人員3人、副高級研究人員3人。創(chuàng)新發(fā)展生物催化技術(shù)，實現(xiàn)傳統(tǒng)化學(xué)法難以實現(xiàn)或污染嚴(yán)重的反應(yīng)，闡明生物催化劑的手性控制機理，建立相關(guān)藥物及精細(xì)化學(xué)品的綠色合成工藝，促進(jìn)化學(xué)工業(yè)的可持續(xù)發(fā)展一直是我們研究團隊的目標(biāo)。近年來實現(xiàn)了甾體藥物、氨基酸、手性醇和手性胺等重要藥物中間體的多項生物催化合成技術(shù)轉(zhuǎn)讓，為企業(yè)創(chuàng)造了經(jīng)濟價值，為其節(jié)能減排、轉(zhuǎn)型提升做出了貢獻(xiàn)?，F(xiàn)承擔(dān)國家自然基金、國家重點研發(fā)計劃項目共4項，中科院和天津市科研項目各2項及企業(yè)合作項目多項，建有2個企業(yè)聯(lián)合實驗室。歡迎有志于從事生物催化研究的生物化學(xué)與分子生物學(xué)、微生物學(xué)、合成生物學(xué)、有機合成化學(xué)等專業(yè)的學(xué)生報考研究團隊的碩士、博士研究生，擁有上述專業(yè)博士學(xué)位的青年才俊加入我們的研究團隊，共同努力實現(xiàn)把科研成果寫在祖國大地上的夢想。
