本文翻譯自LCGC文章，
Modern Trends and Best Practices in Mobile-Phase Selection in Reversed-Phase Chromatography
By Michael W. Dong, Barry E. Boyes
編譯：禹飛樂，李立雄
反相液相色譜（RP-HPLC）在用于定量分析的高效液相色譜（HPLC）中占主導(dǎo)地位，它被用于80%的HPLC應(yīng)用中（1-3）。RP-HPLC使用一種疏水性固定相和一種極性流動相，分析物主要依靠疏水作用來保留。由于優(yōu)秀的精確度和可靠性，帶有UV檢測器的RP-HPLC被用于絕大多數(shù)藥物純度評估、質(zhì)量控制和穩(wěn)定性測試當(dāng)中。其中在穩(wěn)定性預(yù)測分析（Stability-Indicating Analyses）中使用RP-HPLC的另一個原因是出于物料守恒的考慮。RP-HPLC中化合物的保留和其log P（即水和正辛醇中的分配系數(shù)）高度相關(guān)，在這種色譜模式中，分析物與固定相較弱的相互作用力確保分析的樣品中的所有雜質(zhì)在方法梯度結(jié)束前都從柱子上洗脫下來，從而計入樣品中的所有成分（4）。
關(guān)于流動相在調(diào)控RP-HPLC中的中性和離子化分析物的保留和選擇性的作用已經(jīng)在教科書中被廣泛地討論，詳細(xì)信息請參考相關(guān)文獻(xiàn)資料（1-3）。分析物在RP-HPLC中的保留能力可以通過線性溶劑強(qiáng)度模型（5）來預(yù)測，在這個模型中，分析物保留因子的對數(shù)與強(qiáng)溶劑的比例成反比。然而，由于溶質(zhì)和周圍極性溶劑分子的作用而使得這個模型變得非常復(fù)雜，因此Horvath等人提出了“疏溶劑作用模型（Solvophobic Interactions Model）”（6），也指出了吸附在疏水固定相表面的單層強(qiáng)溶劑的作用（1）。同時也存在二級作用，比如堿性基團(tuán)與固定相表面存在的硅醇基團(tuán)的相互作用，這個作用也會導(dǎo)致峰拖尾（7）。
在這篇文章，我們將簡單闡述RP-HPLC中流動相涉及的基礎(chǔ)理論以及流動相選擇的最新趨勢，如TABLE I所示。最明顯的趨勢集中在三個方面：小分子藥及生物藥的穩(wěn)定性預(yù)測分析、提高UV和MS檢測器靈敏度以及堿性分析物峰形的優(yōu)化。
流動相選擇的基礎(chǔ)
在這部分中，我們會講述在RP-HPLC中常見的弱流動相（水相）和強(qiáng)流動相（有機(jī)相）以及流動相的添加劑的選擇標(biāo)準(zhǔn)。
總體趨勢是流動相變得更簡單
雖然色譜柱被稱作液相色譜的心臟，但是流動相在分析物保留和選擇性的調(diào)節(jié)方面也起著重要的作用。色譜柱中填料通常是一種鍵合固定相的高表面積、孔徑可變的硅膠或高分子材料，在固定相和流動相的共同作用下，分析物有了不同的保留時間和遷移速率。在方法開發(fā)過程中，共洗脫的峰可以通過不同的流動相條件無限組合來進(jìn)行微調(diào)，比如溶劑類型、pH、添加劑和操作條件（如溫度、流速和梯度時間）。
然而我們發(fā)現(xiàn)在儀器和色譜柱方面不斷推陳出新時，對流動相中使用的新試劑的開發(fā)卻幾乎處于停滯狀態(tài)?；仡橦PLC的使用歷史，有幾個很實(shí)際的理由來支持使用更簡單的流動相這一趨勢。
首先，色譜柱技術(shù)的進(jìn)步大大減少了峰形優(yōu)化或者色譜柱的批次重現(xiàn)性中對流動相添加劑或者緩沖液的依賴（8）。第二，使用簡單的二元流動相、線性梯度可以簡化方法轉(zhuǎn)移中的調(diào)試過程進(jìn)而增強(qiáng)方法的穩(wěn)健性（9）；最后，LC-MS作為一種標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在高通量篩選、過程監(jiān)控、生物科學(xué)研究、臨床診斷作為標(biāo)準(zhǔn)的迅速崛起也要求更簡單的流動相（10）。
在RP-HPLC中有機(jī)溶劑（或流動相B）的選擇
按照傳統(tǒng)，流動相B代表RP-HPLC中泵混合梯度洗脫中強(qiáng)流動相（有機(jī)溶劑）。類似的，流動相A是弱的水相。
總結(jié)來看，目前RP-HPLC中三種最常用的有機(jī)溶劑是乙腈、甲醇和四氫呋喃。洗脫強(qiáng)度順序是甲醇<乙腈<四氫呋喃（1，2）。比如，一種甲醇：水=44：56的流動相和乙腈：水=35：65以及四氫呋喃：水=28：72在參考的應(yīng)用中有相同的洗脫能力（11）。這三種溶劑在質(zhì)子接受能力、質(zhì)子貢獻(xiàn)能力、偶極作用方面都有顯著的差異（1，11）。在等度分離進(jìn)行條件優(yōu)化時可以有效的利用這三種溶劑的選擇性差異，如Glajch等人在模型軟件的輔助下的實(shí)驗對此進(jìn)行了證實(shí)（12）。
絕大多數(shù)實(shí)驗人員更喜歡乙腈，因為其更強(qiáng)的洗脫強(qiáng)度，更低的粘度（0.37 cP）的特點(diǎn)可以帶來更高的柱效，同時它有更低的截止波長（190 nm）。乙腈是一種非質(zhì)子性溶劑，也是一個帶有π-π作用的質(zhì)子受體（3）。
甲醇是一種質(zhì)子性溶劑，它可以同時作為質(zhì)子給體和質(zhì)子供體。甲醇比乙腈價格更便宜，但是會產(chǎn)生更高的背壓（粘度0.55 cP），特別是和水混合的時候（當(dāng)甲醇：水=50:50時粘度為1.62 cP）（11），甲醇的截止波長為210 nm。
四氫呋喃在RP-HPLC中很少用到，除非需要利用其強(qiáng)溶解能力和洗脫強(qiáng)度。毒性和安全性問題（會形成過氧化物）讓它在凝膠滲透色譜（GPC）以外的使用非常受限。因此，對于流動相B，一般在甲醇和乙腈兩者之間選擇。
甲基叔丁基醚可以作四氫呋喃在低濃度使用時的替代品，因為它在水中的溶解度有限，同時也不會形成過氧化物。由于粘度過高，長鏈脂肪醇比如乙醇、丙醇和丁醇在反相中一般很少使用，但在正相色譜分離手性化合物或者反相色譜分離大分子蛋白中例外。最近幾年很多文章中用到乙腈和正（或異）丙醇甚至正丁醇，據(jù)說有助于提高一些單克隆抗體（mAbs）的回收率。DMSO有非常強(qiáng)的溶解能力但是有非常高的粘度和截止波長（3），同時也不與一些HPLC儀器中使用的高分子材料（比如PEEK）兼容。
含有水和添加劑的流動相B的使用
我們經(jīng)?？吹紿PLC方法中使用規(guī)定的流動相B為類似乙腈：水=95：5這樣的溶液，這是為了使兩種流動相在粘度和表面張力更接近而實(shí)現(xiàn)更充分的混合。但是缺點(diǎn)是降低了流動相B的洗脫強(qiáng)度，也增加了流動相配置的步驟。隨著現(xiàn)代泵和在線混合技術(shù)的提升，這個額外的步驟就逐漸顯得不再那么重要。
另一個常見的操作是同時在A相和B相中使用同樣比例的添加劑，比如在乙腈中添加0.1%的三氟乙酸作為B相，同時在水中添加0.1%的三氟乙酸作為A相。從技術(shù)上講，100%的乙腈和添加了0.1%的三氟乙酸的乙腈對于分離重現(xiàn)性或者洗脫順序方面沒有明顯差異，但是同時在乙腈中添加0.1%的三氟乙酸在梯度方法下可以降低低波長UV檢測時的基線漂移（后面將會更詳細(xì)講到）。
流動相A：pH調(diào)節(jié)劑和緩沖劑
正如上文所述，RP-HPLC中弱的流動相被稱為流動相A，它主要含有水，往往也有少量的改性劑，緩沖劑或鹽來控制pH和離子強(qiáng)度，純水通常被用于分離中性分子。
在藥物分析中，絕大多數(shù)藥物是可離子化的，也就是酸性、堿性或者兩性離子。因此，流動相A的pH必須被調(diào)節(jié)，因為它對分析物的保留有極大的影響?？呻x子化的分析物在不同的pH條件下可以以離子化或非離子化的形式存在，而在RP-HPLC中離子態(tài)比分子態(tài)保留要弱得多。
TABLE II列出了常用的流動相添加劑以及它們各自的pKa和截止波長，可用于LC-MS的揮發(fā)性的緩沖鹽被標(biāo)注了星號。這些添加劑可以作為酸化或者堿化試劑或者通過添加它們對應(yīng)的共軛鹽來作為緩沖液。
酸性添加劑
pH 2-4這個酸性pH范圍被用于多數(shù)的藥物分析，因為這個低的pH可以抑制弱酸性分析物的電離從而獲得更好的保留；堿性分析物在低的pH值下雖然會離子化，但絕大多數(shù)的堿性藥物都有足夠強(qiáng)的疏水性從而可以在離子態(tài)下依然有足夠的保留（3），同時一個酸性的pH也可以抑制色譜柱上殘留的硅醇基團(tuán)的電離，從而減少堿性分析物與這些硅醇的二級作用而形成的拖尾。
常用的酸是TFA、甲酸和乙酸，濃度為0.05-0.1% v/v。在水溶液中，pH情況為：0.1% 三氟乙酸（2.1），0.1%甲酸（2.8），0.1%乙酸（3.2）。這些簡單0.1% v/v的流動相可以通過在1 L純化水中加入1.0 mL的酸，無需進(jìn)一步過濾即可直接使用。它們經(jīng)常被用于LC-MS應(yīng)用，雖然由于它們離子強(qiáng)度較低，可能會使非常堿性的藥物的峰形較差（7，13）。
相對傳統(tǒng)上更喜歡用的磷酸鹽緩沖液， 0.1%的磷酸溶液卻沒這么被廣泛使用。事實(shí)上，磷酸溶液具有易制備、截止波長低（200 nm）等優(yōu)點(diǎn)，它在低UV波長下測定原料藥或者試劑純度的方法中往往有奇效。
緩沖劑
在流動相A的pH需要嚴(yán)格控制的實(shí)驗中，緩沖液的使用就非常關(guān)鍵。根據(jù)Henderson-Hasselbalch方程，緩沖液在它們pKa±1.0的范圍內(nèi)最為有效（1，11）。緩沖液是通過混合一種弱酸和它的共軛堿的鹽（或者一種弱堿和它的共軛酸的鹽）而獲得。
從歷史上來看，HPLC中最常用的緩沖劑是磷酸鹽。因為磷酸有三個可電離的氫，磷酸鹽在pH值為2, 7和10都是有效的。它的截止波長是200nm，但是由于其不可揮發(fā)性，因此不兼容MS。另外，它還有一個缺點(diǎn)是在乙腈里的溶解性差，特別是高濃度的時候（比如50 mM），會在泵混合的時候發(fā)生析出，當(dāng)流動相B為85%的乙腈水或者甲醇可以緩解這個問題。
揮發(fā)性酸的銨鹽也被用于開發(fā)兼容MS的HPLC方法。一種常見的MS兼容的緩沖鹽系統(tǒng)是20 mM甲酸銨，使用甲酸調(diào)節(jié)其pH至3.7。這種流動相條件可以使大多數(shù)的堿性藥物和多肽在現(xiàn)代的色譜柱上有優(yōu)秀的峰形，也有助于保留很多堿性和兩性離子分析物，特別是當(dāng)載樣量增加的時候（7，14）。當(dāng)為了增加RP-HPLC體系中分析物的保留，可以通過利用“鹽析”效應(yīng)或者Le Chatelier規(guī)則，通過增加緩沖鹽濃度來驅(qū)使分析物進(jìn)入疏水的固定相中（1，11）。
堿性流動相
在上世紀(jì)90年代前，硅膠基質(zhì)的色譜柱不能用于高pH的流動相，因為硅膠基質(zhì)會在pH >8時發(fā)生溶解。隨著雜化硅膠顆粒和新的鍵合技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在的硅膠顆粒可以把耐用的pH范圍擴(kuò)展到1-12（當(dāng)柱溫>40℃時耐受pH為2-10）（3，15-16）。典型的高pH流動相時0.05-0.1%的氨水、10-25 mM的碳酸銨或者磷酸鹽。通過比較發(fā)現(xiàn)，隨著流動相pH的升高，流動相緩沖液里硅膠的溶解性顯著增加，因此可以預(yù)料到在高pH和高溫條件下色譜柱的穩(wěn)定性會大大降低（16）。值得注意的是，氫氧化銨目前堿性條件下最安全的選擇，也能和ESI-MS檢測器有很好的兼容。使用高pH來分離的優(yōu)點(diǎn)包括可以增強(qiáng)水溶性堿（比如分析阿片類藥物，傳統(tǒng)上需要離子對色譜）的保留、堿性分析物更好的峰形和MS兼容（15）；缺點(diǎn)是一些藥物在堿性流動相不穩(wěn)定，同時如果流動相pH和堿性分析物的pKa（比如絕大多數(shù)的胺的pKa值在8-10）接近時，會導(dǎo)致可能的方法穩(wěn)定性出現(xiàn)問題（3，15）。
圖1為一個檢測含有兩種API以及過程雜質(zhì)和降解產(chǎn)物的色譜圖（3）。我們可以看到所有的峰在高pH條件下都有非常好的峰形，沒有峰裂分的情況出現(xiàn)。這個方法的缺點(diǎn)是它對流動相pH比較敏感，需要保持在pH 9.10到9.15以防止化合物的共洗脫（3，15）。
圖1 兩種水溶性堿性API（阿片類）及其潛在的雜質(zhì)和一個復(fù)方藥穩(wěn)定性預(yù)測實(shí)驗的降解產(chǎn)物的“雞尾酒”色譜圖（數(shù)據(jù)源于參考文獻(xiàn)3）
圖2進(jìn)一步說明流動相pH對酸性和堿性藥物保留和洗脫順序巨大影響（17）。使用色譜柱篩選酸性和堿性pH的流動相A已經(jīng)在很多實(shí)驗室中最為高通量篩選和方法開發(fā)的常用方法。（3，8-10）。
圖2 一個使用酸性和堿性流動相、梯度方法來分離12個含有酸性（紅色）、堿性（藍(lán)色）和中性（黑色）藥物分子的色譜柱篩選案例（數(shù)據(jù)源自參考文獻(xiàn)17）
減少使用硅醇屏蔽、離子對和離序試劑
在上世紀(jì)90年代前，對于硅膠基質(zhì)的HPLC柱，最被吐槽的是質(zhì)控（QC）方法轉(zhuǎn)移時存在難度，這是由裸硅膠和固定相鍵合時存在批次差異導(dǎo)致。這種不可重現(xiàn)性主要是由于活性硅醇基團(tuán)的存在造成的，同時當(dāng)硅膠基質(zhì)上殘留有金屬離子（比如鋁離子，鐵離子等）時，這些硅醇基團(tuán)的活性更高（1，3）。在當(dāng)時，如果不使用硅醇屏蔽試劑（比如三乙胺），這種帶有酸性硅醇基團(tuán)的固定相會導(dǎo)致堿性分析物無法被洗脫。在藥物分析的常規(guī)檢測當(dāng)中，為了獲得優(yōu)秀的峰形以及穩(wěn)定的重現(xiàn)性，三乙胺往往被頻繁使用（18）。
隨著高純硅膠的普及以及堿性硅膠中金屬雜質(zhì)的消除，色譜柱的硅膠基質(zhì)的硅醇活性逐漸降低，鍵合相的批次重現(xiàn)性也得到很大的改善。使用三乙胺作為添加劑的操作逐漸被淘汰，原因有三：第一是三乙胺會永久改變色譜柱的選擇性；第二是它會抑制正離子模式的所有MS信號；第三是新的色譜柱技術(shù)使用了表面帶電或者其他技術(shù)從而提供了改善堿性分析物峰形的更好的解決方案。
一種最近的創(chuàng)新是在鍵合固定相的表面鍵合一種正電荷（比如胺）。強(qiáng)堿性藥物可以在這些色譜柱上有非常優(yōu)秀的峰形，及時流動相離子強(qiáng)度很低（比如0.1%的甲酸），正如圖3a和3b所示。
圖3 （a）一種通用使用亞3 μm的表面帶電雜化（CSH）色譜柱來分析12種新化合物；（b）使用常規(guī)表面不帶電的色譜柱的對比分析圖譜
另一種方法是使用先進(jìn)的包膜技術(shù)來減少存在的硅醇基團(tuán)的活性。這個方法的附加的好處是使色譜柱可以在高pH條件下使用。
離子對和離序試劑
離子對試劑是像洗潔劑一樣的分子，它們被加入到流動相A中來為酸性或者堿性分析物提供保留（1）。長鏈烷基磺酸鹽（C5到C12）在酸性pH條件下和堿性分析物結(jié)合以形成中性的“離子對”，這種“離子對”就可以在RPLC中保留。保留和離子對試劑的疏水烷基鏈長度以及離子對試劑的的濃度正相關(guān)。需要注意的是，三氟乙酸也有一些離子對能力，也常被用于蛋白和多肽的RP-HPLC分析中。然而由于存在柱效降低、柱平衡變慢、不易使用梯度分析以及質(zhì)譜不兼容等問題，離子對試劑的使用在逐年減少（1，2）。同時，一些公司已經(jīng)生產(chǎn)出有特別表面修飾的HPLC柱從而減少了離子對試劑的使用，通過使用低有機(jī)相甚至無有機(jī)相條件來解決“固定相坍塌”或者“孔去潤濕”問題（3）（可以參考本公眾號文章流動相中水的比例到底多高是太高？）。一些色譜填料在不依賴離子對作用的情況下直接為大極性堿或者酸提供良好保留，保證更好的MS兼容性以及更短的再平衡時間。
另一類用于增加堿性化合物保留和選擇性的添加劑是無機(jī)離域鹽（比如PF6-，BF4-，ClO4-等），這些添加劑可以在酸性條件下和堿性分析物形成中性離子對（1，2）。離序試劑更適合梯度分析，產(chǎn)生的基線偏移更少，但是同樣不兼容MS。（更多關(guān)于離子對試劑的詳細(xì)信息可以參考本公眾號的系列文章RP-HPLC中的離子對試劑（二）：幾類重要的IPRs）。
另外我們可以選擇能高pH的揮發(fā)性流動相緩沖液（比如氫氧化銨），當(dāng)使用合適的硅膠基質(zhì)比如雜化硅膠基質(zhì)色譜柱時，可以提供分析水溶性的堿性藥物非常好的MS兼容的分析方法，因此降低了分析這類化合物時離子對試劑和離序試劑的使用（15）。
其他用于手性分離和離子色譜的流動相添加劑
手性添加劑往往作為衍生化試劑來與手性分析物形成非對映異構(gòu)體，從而使手性分離能夠在傳統(tǒng)的反相柱上實(shí)現(xiàn)（1）。然而，隨著高效廣譜的手性固定相（比如經(jīng)過化學(xué)修飾的多糖）的普及，這種間接的手性分離方法的使用逐漸減少（1-3）。
離子色譜有時候需要用到一種有機(jī)相添加劑（比如3 mM鄰苯二甲酸鈉），通過傳統(tǒng)的HPLC-UV系統(tǒng)用間接的光度測定這個離子復(fù)合物從而實(shí)現(xiàn)離子色譜分析（21）。然而，隨著帶有電導(dǎo)和MS檢測器的離子色譜儀器的普及，這些應(yīng)用有限的方法也逐漸消失。
平衡吸附流動相的使用
當(dāng)在梯度分析中使用UV檢測器設(shè)置的波長比較低（比如230 nm使用兼容MS的流動相）時，我們經(jīng)?？梢杂^察到基線的漂移，這是由于流動相A和B的吸收和折射指數(shù)的不平衡導(dǎo)致的?；€漂移的程度和方向與檢測器流通池的設(shè)計、波長和流動相組成密切相關(guān)。這些不平衡也可以歸咎于這些添加劑在不同的溶劑條件下其基團(tuán)（比如羧基）在UV下吸收的漂移（3），同時流動相A和B的不充分混合也可能造成周期性的基線波動。同樣的，這種基線波動的程度也和在線混合器的設(shè)計、體積以及流動相A和B的吸收差異有關(guān)。（更多關(guān)于基線波動故障排查可以參考本公眾號文章Troubleshooting│HPLC-UV基線波動異常）
圖4a展示了在穩(wěn)定性預(yù)測實(shí)驗方法開發(fā)過程中觀察到的基線漂移。使用了流動相A（0.1%三氟乙酸水溶液），流動相B（含0.1%三氟乙酸的乙腈）（3）。由于三氟乙酸在遠(yuǎn)紫外區(qū)（200-230 nm）的吸收，可以觀察到明顯的基線漂移（230 nm時～0.1 AU）。當(dāng)把三氟乙酸的濃度降低到0.05%時，這些基線問題顯著減少（如圖4b）；當(dāng)把流動相B中三氟乙酸的濃度降低至0.03%時，基線偏移也減少到0.002 Au，這與0.05%三氟乙酸水溶液在230 nm時吸收類似（如圖4c）。
圖4 藥物穩(wěn)定性預(yù)測實(shí)驗中出現(xiàn)的梯度漂移問題 。（a）流動相A和B中都添加0.1%的三氟乙酸；（b）使用平衡吸附流動相，其中流動相A為添加0.05%三氟乙酸的水，B為添加0.03%三氟乙酸的乙腈；（c）0.05%三氟乙酸比水的UV光譜。梯度：25-65% B 15 min；基線漂移：（a）0.1 AU，（b）0.0002 AU，檢測波長：230 nm。
當(dāng)使用UV-vis吸收檢測器時，為獲得最高程度的UV靈敏度，正如上所說，需要對基線性質(zhì)進(jìn)行合適的調(diào)整。
流動相配制的現(xiàn)代趨勢
流動相制備的最新發(fā)展趨勢包括使用更低的緩沖鹽濃度、避免過濾步驟以及調(diào)節(jié)緩沖液pH。
流動相A的更低的緩沖液濃度
雖然在很多比較古老的方法里要求緩沖鹽濃度為50 mM，現(xiàn)在的趨勢是使用更低的緩沖鹽（比如5-20 mM），在這絕大多數(shù)的應(yīng)用中都可以提供足夠的緩沖能力（3）?，F(xiàn)在使用的更低硅醇基團(tuán)殘留或者CSH（表面帶電）的現(xiàn)代色譜柱，已經(jīng)可以使用帶有低離子強(qiáng)度的流動相A，比如0.1%的甲酸溶液的同時保證強(qiáng)堿性分析物的優(yōu)秀峰形（11，13，20）。
避免過濾步驟
很多實(shí)驗室已經(jīng)開始使用高純試劑（比如99.995%的甲酸銨）和HPLC級的有機(jī)溶劑和水，從而避免了使用0.2或0.5 μm的過濾膜過濾的步驟（22）。絕大多數(shù)HPLC泵中的內(nèi)部過濾系統(tǒng)（在維護(hù)保養(yǎng)中更換）已經(jīng)足夠保證絕大數(shù)實(shí)驗室在常規(guī)HPLC操作中不使用過濾操作。這種過濾操作的省略可以減少在過濾過程中潛在的流動相污染。但是當(dāng)使用含有離子對試劑的流動相以及高濃度緩沖鹽或者不能使用高純試劑的時候例外。
類似的，使用真空過濾來對流動相進(jìn)行脫氣也已經(jīng)很大程度被在線脫氣所取代，這種在線真空脫氣已經(jīng)成為最新HPLC儀器的標(biāo)準(zhǔn)配置。
調(diào)節(jié)流動相A的pH
很多分析工作者在配置緩沖液時會把pH計直接浸泡到流動相A中，然后滴定溶液直到達(dá)到設(shè)計的pH值。這種操作存在一定的問題，那就是微量的污染物（比如pH校準(zhǔn)液中的防腐劑）會吸附在pH計上，從而造成梯度洗脫時明顯的鬼峰的出現(xiàn)（如圖5）。為了防止這種污染，分析工作者在測定pH值時，每次都從待測液中取出的少量溶液來測定，直到達(dá)到目標(biāo)pH，取出的少量溶液也不再倒回流動相A中（3）。通過這樣的謹(jǐn)慎操作，我們就可以把高靈敏度分析中可能出現(xiàn)的引入污染物的風(fēng)險盡量最小化。
圖5 在調(diào)節(jié)pH時直接把pH計直接浸泡到流動相A時造成的鬼峰的案例研究。（a）空白梯度；（b）進(jìn)樣。鬼峰隨后被證實(shí)是pH校準(zhǔn)液中使用的防腐劑（苯酚鈉）（數(shù)據(jù)源自參考文獻(xiàn)3）。
梯度方法的最新趨勢
梯度方法的最新趨勢包括使用簡單的二元流動相（比如0.1%的甲酸或者0.1%的氨水），色譜柱內(nèi)填充了高效的表面多孔、硅醇活性低的填料（8）。對于很復(fù)雜的藥物的穩(wěn)健的穩(wěn)定性預(yù)測方法可以通過交叉雙線性梯度來完成（23）。雖然在方法開發(fā)中四元泵也被廣泛使用，在QC方法中使用三元或者四元流動相還是很少見，因為會給跨實(shí)驗室或者儀器平臺的方法重現(xiàn)造成困難，對于這種情況，非常不提倡使用凹或者凸的梯度。使用容易操作的二元流動相時，方法轉(zhuǎn)移時出現(xiàn)的問題就少得多。
流動相穩(wěn)定性的討論
對于流動相配制后的穩(wěn)定性還沒有普遍的指南或者科學(xué)數(shù)據(jù)。很明顯，當(dāng)需要的時候，新鮮的流動相可以每天配置，雖然這種費(fèi)時的過程既沒有必要也不環(huán)保。流動相的儲存壽命很難被估計，因為這取決于流動相組成、pH值、儲存容器、儲存條件以及流動相組成的微小變化對分離的影響的靈敏程度等。微生物（細(xì)菌、藻類和霉菌）生長對系統(tǒng)污染的可能性和色譜柱使用壽命產(chǎn)生了最大的影響。使用保護(hù)柱（比如C18，33×4.6 mm id，10 μm）可以針對流動相產(chǎn)生的顆粒和污染物提供非常好的保護(hù)（24），然而這會增加系統(tǒng)的滯留體積。
一種常用的操作是標(biāo)記所有流動相的日期，水相緩沖液使用一周，簡單酸化的水（比如0.1%的甲酸或者三氟乙酸）使用1-2個月，有機(jī)溶劑最少三個月。對于弱酸性緩沖流動相或者接近中性pH的緩沖液，可以儲存一個濃縮液（10-50倍）。對于特定的緩沖液，冷藏（5℃）可以允許濃縮液使用很多個月，這個方法已經(jīng)很好地被用于儲存乙酸鹽或者甲酸鹽緩沖液。在這種情況下，可以通過定期檢查pH和空白進(jìn)樣來確保流動相制備的清潔度和準(zhǔn)確性。在一些實(shí)驗室中可以建立一些標(biāo)準(zhǔn)操作，比如根據(jù)歷史數(shù)據(jù)來規(guī)定試劑的儲存壽命。在任何情況下，很多規(guī)范的實(shí)驗室都應(yīng)該鼓勵甚至要求標(biāo)記流動相的配制日期。
蛋白和多肽RP-HPLC分析的新添加劑
用RP-HPLC分離蛋白和多肽是一個挑戰(zhàn)，因為實(shí)現(xiàn)這類物質(zhì)的分離需要低硅醇活性的色譜柱，也需要特殊的流動相添加劑以實(shí)現(xiàn)低UV波長（210-220 nm）檢測和高的柱溫（>60℃）以改善峰形，同時也可能存在回收率的問題（2，3）。
蛋白和多肽的傳統(tǒng)流動相A是0.1%的TFA，具有離子對能力的三氟乙酸可以讓峰形更佳，同時可以讓肽鍵可以在210-220 nm波長下有一定的UV靈敏度。雖然從沸點(diǎn)的角度來看，三氟乙酸兼容MS，但是當(dāng)MS使用ESI模式時其靈敏度將大打折扣，因為三氟乙酸會產(chǎn)生離子抑制。三氟乙酸對于一級?-氨基賴氨酸基團(tuán)以及N-末端 α-氨基基團(tuán)可以發(fā)揮非常優(yōu)秀的離子對作用。除了作為一種酸性添加劑外，三氟乙酸還可以增強(qiáng)酸性多肽的保留，因為與N-末端氨基形成了離子對，這種離子對作用在甲酸流動相里并不明顯存在。然而，和甲酸相比，使用三氟乙酸對于使用MS作為蛋白和多肽的檢測器時靈敏度會受到很大的影響。隨后出現(xiàn)受到一定歡迎的方法，那就是在流動相A和B中加入更低濃度的三氟乙酸，同時加入相等或者更高濃度的甲酸以在ESI的氣相交換過程中和三氟乙酸競爭（25，26）。
最近Boyes等人通過研究發(fā)現(xiàn)了兩種非常有潛力的添加劑，它們可以在峰形和MS靈敏度間取得好的平衡：二氟乙酸和3-氟丙酸（26）。圖6展示了這四種添加劑（甲酸，甲酸銨/甲酸，三氟乙酸和二氟乙酸）在HPLC-UV-MS中分析五種多肽混合物相對表現(xiàn)。HPLC-UV和TIC（Total Ion Chromatogram）數(shù)據(jù)顯示二氟乙酸在峰形和選擇性方面在UV和MS檢測器條件下都表現(xiàn)優(yōu)秀。
圖6 （a）甲酸，（b）甲酸和甲酸銨的混合物，（c）三氟乙酸，（d）二氟乙酸作為流動相添加劑在MS檢測器條件下測試其峰強(qiáng)度，保留，峰寬和分離度（數(shù)據(jù)源自參考文獻(xiàn)25）。
圖7展示了在一種蛋白分析中在流動相A中使用三氟乙酸、二氟乙酸和甲酸的色譜圖。
