ScoE與異腈的生物合成直接相關(guān)，本文解析了高分辨率的ScoE與其底物及推測(cè)中間體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合生物化學(xué)與生物物理學(xué)的手段，闡明了鐵(Fe)和α-酮戊二酸(2OG)依賴性的ScoE催化異腈形成的分子機(jī)理，揭示了ScoE的催化功能。對(duì)比典型的Fe/2OG，這個(gè)反應(yīng)是一個(gè)四電子氧化脫羧及去飽和反應(yīng)的過程，并且歷經(jīng)了兩次催化循環(huán)。
許多具有良好活性的天然產(chǎn)物中都存在異腈官能團(tuán)。例如，抗病毒藥黃嘌呤素，與毒性相關(guān)的酚氧化酶抑制劑-鼠李素以及許多海洋海綿衍生的代謝物等。但遺憾地是，此前對(duì)于異腈的生物合成只能通過5-磷酸化的核酮糖與酪氨酸或者色氨酸進(jìn)行分子間的縮合得到(Brady, S. F. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2005, 44, 7063-7065.)。2017年，加州大學(xué)伯克利分校的張文君課題組首次報(bào)道了以甘氨酸前體的異腈分子內(nèi)生物合成途徑(Harris, N. C. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 2017,114, 7025-7030.)，確認(rèn)ScoE蛋白與異腈的生物合成直接相關(guān)。2018年，該課題組與麻省理工學(xué)院的Drennan課題組合作解析了ScoE母體的晶體結(jié)構(gòu)，證實(shí)ScoE屬于Fe/2OG依賴性的加氧酶家族(Harris, N. C. et al. Angew. Chem. Int. Ed. 2018, 57,9707-9710.)。但在晶體結(jié)構(gòu)中，他們捕捉到的是含鋅(Zn)離子，而且缺乏與底物結(jié)合的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，故由ScoE介導(dǎo)的異腈的生物合成催化機(jī)理仍然需要進(jìn)一步的研究和闡釋（Figure1）。
Figure 1. 兩種不同的異腈生物合成方式。A) IsnA酶家族利用5-磷酸化的核酮糖合成異腈；B)鐵(Fe)和α-酮戊二酸(2OG)依賴性加氧酶催化的異腈合成
最近，美國(guó)北卡羅來納州立大學(xué)的張瑋成課題組、卡內(nèi)基梅隆大學(xué)郭以嵩課題組及中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所的周佳海課題組合作，解析了高分辨率的S. coeruleorubidus 來源的ScoE與其底物及推測(cè)中間體的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，同時(shí)結(jié)合生物化學(xué)與生物物理學(xué)的手段，闡明了鐵(Fe)和α-酮戊二酸(2OG)依賴性的ScoE催化異腈形成的分子機(jī)理（Figure2），揭示了ScoE的催化功能。對(duì)比典型的Fe/2OG，這個(gè)反應(yīng)是一個(gè)四電子氧化脫羧及去飽和反應(yīng)的過程，并且歷經(jīng)了兩次催化循環(huán)。
Figure 2. Fe和2OG依賴性加氧酶催化的異腈生物合成機(jī)理
在前期工作中，張瑋成課題組發(fā)現(xiàn)了與ScoE同功能的兩個(gè)酶，它們分別是來自Streptomyces avermitilis的SAV607和S. thioluteus的SfaA。對(duì)于這三個(gè)酶，周佳海課題組都進(jìn)行了結(jié)晶條件的篩選，最終獲得了ScoE與底物(1)和推測(cè)中間體(3)以及SfaA的母體結(jié)構(gòu)，分辨率分別為2.18 ?、2.17 ?和2.23 ?。在ScoE?Fe?1晶體結(jié)構(gòu)中，Y101、K193、G128、Y96、Y135和R310與底物(1)之間的氫鍵作用可能起到錨定的作用，從而其電子密度可以被完整并清晰地觀察到。另外，底物(1)中C5-距離鐵中心的距離為4.9 ?，而經(jīng)Fe/2OG催化得到的推測(cè)中間體(3)朝鐵中心移動(dòng)了0.4 ?，縮短為4.5 ?（Figure3）。
Figure 3. A) ScoE?Fe?1的整體結(jié)構(gòu)；B) ScoE?Fe?1和ScoE?Fe?3活性位點(diǎn)。H132、D134和H295構(gòu)成一個(gè)催化三聯(lián)體，酒石酸(TAR)和甲酸(FMT)分子分別占據(jù)了2OG結(jié)合的位點(diǎn)。在Fe/2OG催化體系中，Fe(II)被O2氧化形成Fe(IV)-oxo，而2OG則會(huì)變成琥珀酸。為了進(jìn)一步闡明反應(yīng)途徑，張瑋成課題組巧妙地通過定量催化時(shí)琥珀酸和產(chǎn)物(2)構(gòu)建了2OG和底物(1)的化學(xué)計(jì)量關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，SfaA、Sav607和ScoE催化反應(yīng)時(shí)，琥珀酸和產(chǎn)物(2)的比例分別為2.3、3.2和4.5，揭示了異腈產(chǎn)物(2)的形成中可能涉及了兩個(gè)Fe/2OG的催化循環(huán)。值得注意的是，當(dāng)SfaA催化反應(yīng)時(shí)，同位素標(biāo)記的類似物(5-13C-1)與2OG的比例為1:1.5時(shí)，13C的C-H去耦合譜在~91ppm出現(xiàn)了一個(gè)新峰，同時(shí)C-H耦合譜于同一位置出現(xiàn)了雙峰，暗示了推測(cè)中間體(3)的生成。隨后，當(dāng)5-13C-1與2OG的比例增加到1:2.5，作者觀察到(3)的減少以及~150ppm處另一個(gè)新峰的生成。經(jīng)證實(shí)，新峰與(2)的化學(xué)位移一致，這表明(3)可能作為底物參與了(2)形成的第二個(gè)Fe/2OG催化循環(huán)（Figure4）。Figure 4. SfaA催化合成產(chǎn)物(2)的13C-NMR此外，郭以嵩課題組通過穆斯堡爾（M?ssbauer）光譜分析證實(shí)了第一個(gè)Fe/2OG催化循環(huán)中Fe(IV)-oxo的形成。SfaA?Fe(II)?2OG?5-2H2-1和SfaA?Fe(II)?2OG?1的光譜中觀測(cè)到的四極雙峰具有異構(gòu)體位移值（δ）為1.23 mm/s和四極分裂值(ΔEQ) 為2.74 mm/s。這樣的四極雙峰譜證實(shí)了鐵中心在這兩個(gè)酶的靜止態(tài)是處于高自旋亞鐵。當(dāng)酶和底物5-2H2-1的反應(yīng)在0.03 s被淬滅時(shí)，復(fù)合物SfaA?Fe(II)?2OG?5-2H2-1減少了30%，同時(shí)累積了一個(gè)新物種，而該新物種與其他的Fe/2OG酶催化中的Fe(IV)-oxo中間體類似（Figure5）。因此，M?ssbauer光譜分析暗示反應(yīng)可能從底物(1)中C5-的C-H羥化開始。
Figure 5. SfaA?Fe(II)?2OG?5-2H2-1和SfaA?Fe(II)?2OG?1的M?ssbauer光譜分析中間體(3)可能通過途徑(i)生成化合物(4)，緊接著(4)和(5)的C5-羥化后，快速地互變異構(gòu)形成(6)，接著再脫水或脫羧形成產(chǎn)物(2)。不過，中間體(3)直接羥化形成(6)后，通過(7)產(chǎn)生(2)也是另一種可能的途徑(i)。為了揭示第二個(gè)循環(huán)中可能的反應(yīng)途徑，張瑋成課題組合成了可能的中間體(4)和(6)，但遺憾地是，cis-(4)和(6)和酶反應(yīng)時(shí)均未檢測(cè)到產(chǎn)物(2)。因此他們懷疑cis-(4)和(6)也許并不是活性位點(diǎn)真正的中間體而是trans-(4)。或者存在第二種途徑，Fe(IV)-oxo活化N4-經(jīng)脫水形成(8)，然后脫羧形成(2)，即(3)→(8)→(2)。總體來說，作者利用生物化學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)和M?ssbauer光譜分析揭示了Fe/2OG依賴的酶催化異腈生物合成途徑經(jīng)歷了兩個(gè)不同的反應(yīng)。在第一個(gè)反應(yīng)中，Fe/2OG催化底物(1)形成C5-羥化的中間體(3)，而第二個(gè)反應(yīng)中可能是通過一個(gè)脫羧協(xié)助的去飽和反應(yīng)由中間體(3)最終形成產(chǎn)物(2)，詳細(xì)的機(jī)理還需要進(jìn)一步的證實(shí)。張瑋成課題組的博士生Tzu-Yu Chen和周佳海課題組的博士生陳金鳳并列論文第一作者。晶體衍射數(shù)據(jù)分別在上海光源BL17U1和BL19U1線站收集。
張瑋成博士，畢業(yè)于德州大學(xué)奧斯丁分校，北卡羅萊納州立大學(xué)助理教授，主要研究鐵和a-酮戊二酸氧化酶的催化合成機(jī)理。研究結(jié)合有機(jī)合成、生物化學(xué)以及生物物理學(xué)等多學(xué)科，探討異腈基、雙鍵、環(huán)氧等官能團(tuán)在天然產(chǎn)物生物合成過程中的酶學(xué)機(jī)理，進(jìn)而尋找潛在的候選藥物。在Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem、Org. Lett. 等期刊上發(fā)表論文，引用次數(shù)高達(dá)1380次。主持美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生研究院（NIH）、美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金（NSF）項(xiàng)目。榮獲Faculty Research and Professional Development Program Award, North Carolina State University、Faculty Early Career Development Program (CAREER) Award: National Science Foundation。擔(dān)任J. Am. Chem. Soc.、PNAS、Nat Commun、Nat Prod Rep及ACS Chem Biol等國(guó)際知名期刊審稿人。課題組主頁(yè): https://changlab.wordpress.ncsu.edu/郭以嵩博士，美國(guó)卡內(nèi)基梅隆大學(xué)化學(xué)系副教授。研究方向?yàn)榉?/span>卟啉鐵蛋白酶和鐵硫蛋白酶的催化機(jī)理，主要研究對(duì)象是鐵和α酮戊二酸氧化酶催化機(jī)理，包括去飽和反應(yīng)、環(huán)氧化反應(yīng)、內(nèi)過氧化反應(yīng)和異腈生物合成反應(yīng)。課題組結(jié)合運(yùn)用酶動(dòng)力學(xué)和光譜學(xué)（包括M?ssbauer、EPR和基于同步輻射技術(shù)的光譜學(xué)）捕捉和表征催化中間體，同時(shí)運(yùn)用量子化學(xué)計(jì)算推導(dǎo)中間體電子結(jié)構(gòu)以獲得對(duì)催化機(jī)理深層次的理解。在Nature、Science、J. Am. Chem. Soc.、Angew. Chem、Biochemistry 等期刊上發(fā)表論文五十幾篇。目前課題組非卟啉鐵蛋白酶研究得到美國(guó)衛(wèi)生研究院（NIH） R01和美國(guó)國(guó)家科學(xué)基金會(huì)（NSF） CAREER經(jīng)費(fèi)支持，鐵硫蛋白酶研究得到美國(guó)能源部經(jīng)費(fèi)支持。課題組主頁(yè)：www.chem.cmu.edu/groups/guo周佳海博士，中國(guó)科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所研究員。主要研究方向是工業(yè)生物技術(shù)、合成生物學(xué)相關(guān)的微生物酶學(xué)以及活性天然產(chǎn)物的化學(xué)生物學(xué)，通過會(huì)聚酶學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)及蛋白質(zhì)理性設(shè)計(jì)等技術(shù)方法，重點(diǎn)研究酶的結(jié)構(gòu)與催化機(jī)理、機(jī)制與分子改造、定向進(jìn)化酶的科學(xué)規(guī)律等，近年來陸續(xù)在Nature、Nat Chem、Nat Chem Biol、PNAS、J Am Chem Soc、Angew Chem、Nat Commun 和ACS Catalysis 等期刊上發(fā)表研究成果。榮獲中國(guó)科學(xué)院“百人計(jì)劃”擇優(yōu)支持（2008）、藥明康德生命化學(xué)獎(jiǎng)“學(xué)者獎(jiǎng)”（2018）陜西省千人計(jì)劃創(chuàng)新短期項(xiàng)目（2018）、上海市優(yōu)秀學(xué)術(shù)帶頭人項(xiàng)目（2019）。目前主持和參與國(guó)家自然科學(xué)基金重點(diǎn)項(xiàng)目、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃合成生物學(xué)專項(xiàng)、中科院國(guó)際合作項(xiàng)目等。
