第一部分 色譜基礎(chǔ)知識
1、色譜起源
2、色譜定義
色譜法：利用組分在兩相間分配系數(shù)不同而進(jìn)行分離的技術(shù)
流動(dòng)相：攜帶樣品流過整個(gè)系統(tǒng)的流體
固定相：靜止不動(dòng)的一相，色譜柱
3、色譜分類
1、高效液相色譜 High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
2、氣相色譜 Gas Chromatography (GC)
3、薄層色譜 Thin-Layer Chromatography (TLC)
4、毛細(xì)管電泳 Capillary Electrophoresis(CE)
4、色譜優(yōu)點(diǎn)
1、同時(shí)分析
2、分離性能好
3、靈敏度高 (ppm-ppb)
4、進(jìn)樣量小 (1-100uL)
HPLC vs GC
液相色譜：以液體作為流動(dòng)相的色譜分離方法
1、適用于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分析
2、流動(dòng)相具有運(yùn)載樣品分子和選擇性分離的雙重作用
氣相色譜：以氣體作為流動(dòng)相的色譜分離方法
1、適用于沸點(diǎn)較低、熱穩(wěn)定性好的中小分子化合物的分析
2、流動(dòng)相只起運(yùn)載樣品分子的能力
5、HPLC分類
1、正相模式 (NP-LC)
2、反相模式 (RP-LC)
3、反相離子對色譜 (IPC)
4、離子交換色譜 (IEC)
5、尺寸排阻色譜 (GPC / GFC)
反相模式 (RP)
填料：C18 (ODS)、C8 (octyl)、C4 (butyl)、苯基、TMS和氰基
相互作用力：
反相模式下流動(dòng)相的選擇：
優(yōu)化水相（緩沖液）和有機(jī)相的比例非常重要（甲醇，乙腈和 THF 是常用的有機(jī)溶劑）
在有緩沖液的情況下, 緩沖液的濃度和pH值非常重要
增加流動(dòng)相極性：
固定相極性變化對分離的影響：
固定相極性變化對分離的影響：
離子對色譜
離子對試劑
?陰離子化合物：氫氧化四丁基銨、溴化四丁基銨
?陽離子化合物：丁烷基磺酸鈉(C4)、戊烷基磺酸鈉(C5)、己烷基磺酸鈉(C6）、庚烷基磺酸鈉(C7)、辛烷基磺酸鈉(C8)、癸烷基磺酸鈉(C10)、十二烷基磺酸鈉(SDS)
離子對色譜影響因素
?離子對試劑的類型
?離子對試劑的濃度
?流動(dòng)相的pH
正相色譜
色譜柱：
?硅膠柱:常用
?氰基柱: 常用
?氨基柱: 分析糖
?二醇基柱: 分析蛋白質(zhì)
相互作用力
氫鍵力
?如果樣品有
–-COOH: 羧基
–-NH2: 氨基
–-OH: 羥基
則氫鍵力強(qiáng).
?如果樣品沒有任何官能團(tuán)，象碳水化合物
?如果樣品有大的基團(tuán), 由于空間障礙
則氫鍵力弱.
正相模式下流動(dòng)相的選擇：
?主要試劑：烷烴(戊烷, 己烷, 庚烷, 辛烷)、芳香烴(苯, 甲苯, 二甲苯)、二氯甲烷–氯仿、四氯化碳
?輔助試劑：甲基-t-丁基醚(MTBE)、乙醚、四氫呋喃(THF)、二氧雜環(huán)乙烷、嘧啶、乙酸乙酯、乙腈、丙酮、異丙醇、乙醇、甲醇
為了調(diào)整保留時(shí)間，可以選擇主要試劑然后再加入輔助試劑。
增加流動(dòng)相極性：
反相色譜與正相色譜的對比：
反相：保留時(shí)間重復(fù)性好、固定相耐用
正相：對立體異構(gòu)體有很好的分離(Vitamin E等)、保留時(shí)間重復(fù)性稍差
離子交換色譜：
離子交換色譜應(yīng)用：
生物領(lǐng)域(蛋白質(zhì), 農(nóng)藥, 氨基酸分析)
離子分析
陽離子交換劑：強(qiáng)陽離子交換劑(SCX)(R-SO3-)
弱陽離子交換劑(WCX) (R-COO-)
陰離子交換劑：強(qiáng)陰離子交換劑(SAX) (R4N+)
弱陰離子交換劑(WAX)(DEAE)
尺寸排阻色譜法（SEC）
第二部分 柱子基本性能參數(shù)
1、表征色譜柱的參數(shù)
硅膠純度：填料硅膠的純度與殘留金屬離子濃度。
色譜柱尺寸：填料床的長度和內(nèi)徑。
顆粒形狀：球型或不規(guī)則型。
粒徑：平均顆粒直徑,通常3-10μm。
表面積：顆粒外表面和內(nèi)部孔表面的總和,以m2/g表示。
孔徑：顆粒的孔或腔的平均尺寸,范圍80-300?。
碳百分率：與基體物質(zhì)相連的鍵合相的量。
封尾：用短鏈將裸露的硅羥基鍵合后封閉起來。
2、表征色譜柱性能的參數(shù)
（1）容量因子, k'
（2）理論塔板數(shù), N
（3）分離度, Resolution
完全分離時(shí)的分離度
