做藥物研發(fā)、分析的小伙伴對生物堿肯定不陌生，對它的檢測難度肯定也不陌生。是什么導(dǎo)致的生物堿測定困難呢？有什么好的解決嗎？今天就和大家好好聊一聊關(guān)于堿性化合物檢測困難的原因，以及相應(yīng)的解決辦法。生物堿是天然產(chǎn)物中藥用活性較好的一類化合物，大量地存在于植物當(dāng)中，也有部分存在于動物中。
早在19世紀(jì)初, 植物化學(xué)家就一直致力于生物堿的純化制備, 通過溶劑萃取、硅膠柱層析、結(jié)晶等植化手段獲得了大量生物堿, 并開發(fā)出眾多的堿性藥物。但由于傳統(tǒng)技術(shù)的局限, 對生物堿分離、純化的收率往往很低， 直到高效液相色譜的出現(xiàn)，才讓科學(xué)家對生物堿的分離看到新的希望，然而，在液相色譜的分離檢測過程中也出現(xiàn)了諸多問題。
最主要的就是峰形拖尾，由于生物堿往往峰寬較寬，峰高較矮，檢測靈敏度較差，而提高進(jìn)樣量又會導(dǎo)致色譜峰拖尾加劇，柱效迅速降低，相鄰的成分更容易被拖尾峰包裹等等，這一些問題，都為堿性化合物的檢測帶來難度。
今年來，科學(xué)家們一直在尋找造成堿性化合物的峰形拖尾的原因，以及相應(yīng)的解決辦法。
我們都知道，高效液相色譜分析的 3 個(gè)最基本要素是固定相、流動相、目標(biāo)分析物。因此，不難得出：堿性化合物的拖尾現(xiàn)象，與這三個(gè)要素息息相關(guān)，任何一個(gè)環(huán)節(jié)出在非理想狀態(tài)，都會導(dǎo)致拖尾的現(xiàn)象出現(xiàn)。接下來，咱們就從這固定相和流動相入手，分別討論可能的原因，探尋出拖尾的真相。
C18 色譜柱是反相分析方法中最常用的色譜柱。C18，十八烷基鍵合硅膠，是將十八烷基鏈鍵合在硅膠上而得。但是，由于十八烷基碳鏈很長，鍵合的時(shí)候空間位阻非常大，導(dǎo)致鍵合率不高，這樣，便會殘留大量未被鍵合的硅羥基。硅羥基在一些反相流動相中，容易解離。
由于硅膠鍵合相容易溶解在堿性介質(zhì)中，因此，大多數(shù)的反相 HPLC 方法都是在酸性或者中性的流動相條件，堿性化合物在酸性或者在中性流動相環(huán)境下，由于解離平衡的關(guān)系，便會以離子形式存在，帶正電荷。堿性越強(qiáng)，解離越容易。由于游離的硅羥基與解離后堿性化合產(chǎn)生的二級作用，導(dǎo)致了堿性化合物峰行出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象。
分析堿性化合物時(shí)，選擇硅羥基活性小的鍵合相是獲得良好峰形的關(guān)鍵。超純硅膠成了固定相的首選材料，一般都有 99.99%以上的純度，金屬殘留量極低，使得鍵合率增加，游離的硅羥基減少。為了進(jìn)一步降低游離硅羥基的活性，許多科學(xué)家都做了大量的研發(fā)工作，直到1999年，默克公司基于超高純硅膠，推出了一款聚合封尾技術(shù)的液相色譜柱Purospher? STAR RP-18e。目前，端基封尾技術(shù)是解決這一問題最有效的辦法。
所謂的端基封尾，即在完成鍵合之后，再用一個(gè)小分子的化合物，如三甲基硅氧烷（TMS）,把剩余的游離硅羥基盡可能多得鍵合上去，這樣便可以進(jìn)一步降低硅羥基的活性。
Purospher? STAR獨(dú)特的聚合封尾技術(shù)
同時(shí)，分析堿性化合物的色譜柱還需要較寬pH值耐受范圍；以及可以耐受100%純水相（適用于反相條件下，極性化合物的保留和分析。）
Purospher? STAR RP-18e在pH 10.5分析條件下的穩(wěn)定性Purospher? STAR RP-18e在100%純水相條件下極性化合物分析的穩(wěn)定性（A:第一針; B:連續(xù)進(jìn)樣3小時(shí)）由此可見，使用正確、具有針對性的液相的譜柱可以完美地解決堿性化合物峰拖尾這一難題。除此之外，優(yōu)秀的液相色譜柱還應(yīng)該具有超低的柱流失，還可以搭配通用型檢測器（包括LC-MS分析）等優(yōu)點(diǎn)。Purospher? STAR RP-18e可為LC-MS分析提供超低柱流失
另外，堿性化合物拖尾的另一個(gè)原因是鍵合過程中殘留的鹵代集團(tuán)造成的。鍵合相的合成一般是將鹵代硅烷化烷烴和在交聯(lián)硅膠通過置換作用，生成鍵合相。由于鹵代基的強(qiáng)電負(fù)性，表面會成負(fù)電荷模式，與堿性化合物形成二級反應(yīng)，造成拖尾。通過調(diào)節(jié)流動相去改善堿性化合物的峰形也是一個(gè)必要方式?？梢詮囊韵?個(gè)方面進(jìn)行調(diào)整。使用離子對試劑增強(qiáng)堿性化合物的保留，改善堿性化合物峰形。適合堿性化合物的離子對試劑有庚烷磺酸鈉、己烷磺酸鈉、十二烷基烷磺酸鈉等。
酸性條件下，堿性化合物的陽離子會和烷基磺酸根陰離子形成中性離子對，使堿性化合物變成中性化合物，并增強(qiáng)疏水性。
最常用的掃尾劑是三乙胺，有時(shí)也可以使用二乙胺。當(dāng)我們發(fā)現(xiàn)堿性化合的峰形出現(xiàn)拖尾時(shí)，在流動相里添加1%左右的三乙胺，再用磷酸把流動相調(diào)回酸性，往往可以起到立竿見影的效果。
酸性條件下，三乙胺陽離子和鍵合相中游離的硅羥基結(jié)合，占據(jù)鍵合相中所有與堿性化合物作用的活性中心，屏蔽堿性化合物的二級作用，改善峰形。當(dāng)遇到堿性比三乙胺更強(qiáng)的堿性化合物時(shí)，三乙胺的作用就不明顯了。
對堿性化合物來說，流動相的 pH 不僅僅對峰形，還對保留因子和選擇性都有很大影響。一般來說，我們建議堿性化合物的流動相 pH≤2.5,會有比較好的峰形。
a.堿性化合物在酸性條件下會解離成離子狀態(tài)；b.pH≤2.5 會使固定相游離硅羥基解離受抑制，減小對堿性陽離子的二級反應(yīng)。
當(dāng)pH=2.5 的時(shí)候，解離平衡向左移動，非解離狀態(tài)的構(gòu)型會比平衡狀態(tài)時(shí)增加 90%，解離狀態(tài)的構(gòu)型降為平衡狀態(tài)時(shí)的 10%。
使用緩沖鹽的目的主要有兩點(diǎn)，其一是使流動相維持在一個(gè)相對穩(wěn)定的 pH 條件；其二是使流動相具有足夠的離子強(qiáng)度。那么，選擇緩沖鹽的類型和濃度就非常重要了。
高濃度緩沖鹽中金屬離子“包裹”游離硅羥基，并呈正電狀態(tài)，阻斷堿性化合物與固定相的二級反應(yīng)，減小拖尾，改善峰形。緩沖鹽的弱酸根（陰離子）作用是維持流動相體系在一個(gè)穩(wěn)定的 pH 環(huán)境，提高方法重現(xiàn)性。
說了這么多，解決問題的關(guān)鍵還是選擇正確的色譜柱，希望小伙伴在做堿性化合物分析的時(shí)候，可以挑選具有針對性的色譜柱，避免浪費(fèi)人力物力，節(jié)約實(shí)驗(yàn)成本。注：Purospher? STAR RP-18e除了可以解決堿性化合的檢測難題，對配位化合物的檢測問題也是“藥到病除”。
Purospher? STAR RP-18e為配位化合物分析提供完美峰形
Purospher? STAR還有RP-8e/Phenyl/NH2/Si等鍵合相產(chǎn)品。
以上的所有辦法，未必能解決實(shí)際分析中的所有問題，我們只是希望能起到拋磚引玉的作用，可以啟發(fā)色譜分析從業(yè)人員，特別是一些“新手”，使你在碰到問題的時(shí)候，可以結(jié)合待測樣品的實(shí)際情況，嘗試自己去分析可能的影響因素，并有針對性的探索出解決方案。
