酶由于其催化反應(yīng)的高效性和專一性，已經(jīng)在工業(yè)上有越來越多的應(yīng)用。經(jīng)過改造之后的酶表現(xiàn)出期望的活性和選擇性，但是通常只有很有限的底物適用范圍。盡管這一專一性在某一具體催化過程很有用，但也限制了酶在早期藥物發(fā)現(xiàn)階段的應(yīng)用，因?yàn)樵缙谕枰煌牡孜飦泶罅慨a(chǎn)生各種不同的分子。目前新興的策略是利用酶催化來產(chǎn)生一個(gè)手性合成子，再進(jìn)行后續(xù)的衍生化。近日，美國加州理工學(xué)院Frances H. Arnold課題組報(bào)道了利用海洋紅嗜熱鹽菌一氧化氮雙加氧酶（RmaNOD）的突變體催化產(chǎn)生頻哪醇硼酸酯取代的環(huán)丙烷的順式和反式的非對(duì)映異構(gòu)體，當(dāng)進(jìn)行后續(xù)衍生化可產(chǎn)生各種手性純的環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的化合物。酶催化下的環(huán)丙烷化與傳統(tǒng)的化學(xué)合成相比，不再需要手性配體、昂貴的過渡金屬催化劑以及較好反應(yīng)活性的底物，并且減少了有機(jī)溶劑的使用。環(huán)丙烷化產(chǎn)物上的頻哪醇硼酸酯基團(tuán)可以進(jìn)行Suzuki?Miyaura偶聯(lián)反應(yīng)，從而產(chǎn)生立體純的環(huán)丙烷衍生物。
為了尋找具有該催化活性的起始酶，作者以乙烯基硼酸酯為底物，EDA為卡賓前體，篩選了一系列血紅素蛋白，包括細(xì)胞色素P411、細(xì)胞色素c、肌紅蛋白等。最后，作者發(fā)現(xiàn)來源于海洋紅嗜熱鹽菌的一氧化氮雙加氧酶（RmaNOD）突變體Q52A具有微弱的催化活性，產(chǎn)生反式構(gòu)型的化合物3。在獲得RmaNOD Q52V的晶體結(jié)構(gòu)之后，作者選取了口袋末端的氨基酸殘基進(jìn)行單位點(diǎn)迭代飽和突變。在第一輪突變中，作者發(fā)現(xiàn)Y32T導(dǎo)致非對(duì)映選擇性的改變，更傾向于產(chǎn)生順式構(gòu)型的化合物3并且將反應(yīng)效率提高了24倍，TTN達(dá)到了420，dr值達(dá)到了90:10，ee值大于99%。再一輪的突變作者篩選到了Y32T, Y39H, L48R, Q52A, R79W，重組之后獲得突變體RmaNOD THRAW，進(jìn)一步提高了催化的效率，TTN達(dá)到了1300，dr值達(dá)到了94:6，ee值大于99%（圖1a）。之后，作者考慮提高反式的產(chǎn)物3的產(chǎn)率，利用同樣的策略篩選出了突變體L20W, Q52A, L56I, L60H, L101N, I105M，重組之后得到RmaNOD WAIHNM催化底物產(chǎn)生反式構(gòu)型的化合物3，TTN達(dá)到了2000，dr值小于1:99，ee值大于99%（圖1b）。
圖1
（圖片來源：ACS Catal.）
之后作者又嘗試了該酶催化下的克級(jí)規(guī)模的反應(yīng)，最終以36%分離產(chǎn)率拿到3.7 g的化合物3。為了確定產(chǎn)物的絕對(duì)構(gòu)型，作者將其轉(zhuǎn)化為三氟硼酸鉀鹽進(jìn)行結(jié)晶（圖2a）。作者發(fā)現(xiàn)3在水相的緩沖液中會(huì)部分的脫去頻哪醇保護(hù)基團(tuán)；作者還通過簡(jiǎn)化催化劑的形式和產(chǎn)物分離的步驟進(jìn)一步提高了產(chǎn)率。為了證明該方法的實(shí)用性，作者利用該方法合成的手性環(huán)丙烷硼酸酯與帶有各種不同取代基的芳基進(jìn)行偶聯(lián)，均獲得了手性保持的偶聯(lián)產(chǎn)物，并顯示出很好的官能團(tuán)耐受性。作者還提出結(jié)合酶催化環(huán)丙烷化和表面活性劑助力的偶聯(lián)反應(yīng)實(shí)現(xiàn)一鍋法制備手性環(huán)丙烷衍生物的合成。
圖2
（圖片來源：ACS Catal.）
總的來說，作者通過結(jié)合生物催化劑的專一性和小分子催化劑的廣泛底物范圍，發(fā)展了一種化學(xué)酶法的策略，可以快速地產(chǎn)生各種包含立體純環(huán)丙烷結(jié)構(gòu)的化合物，這將有助于在早期藥物發(fā)現(xiàn)階段來構(gòu)建手性小分子庫。
