YcaO是最初注釋為DUF181的一個(gè)未知功能的結(jié)構(gòu)域，常見于許多細(xì)菌來源的RiPPs天然產(chǎn)物的生物合成過程中。隨著RiPPs生物合成過程的研究及酶的生化研究，YcaO蛋白的功能逐漸被研究出來。目前被證實(shí)的功能主要是負(fù)責(zé)形成thiazoline, oxazoline和 methyloxazoline五元氮雜環(huán)，這一過程起始于L-Cys、L-Ser或L-Thr親核側(cè)鏈對羰基的進(jìn)攻，接著在ATP的作用下中間體進(jìn)行磷酸化，磷酸基團(tuán)離去后形成脫一分子水的azolines雜環(huán)。在FMN依賴的脫氫酶作用下，azolines可被繼續(xù)氧化產(chǎn)生azoles (Figure 1A)。許多RiPPs中都含有azoles雜環(huán)，如LAPs (linearazole-containing peptides), cyanobactins 和thiopeptide antibiotics等。
Thiopeptide antibiotics是一類富含硫原子且結(jié)構(gòu)高度修飾的RiPPs，大環(huán)系統(tǒng)含有一個(gè)含氮的中心結(jié)構(gòu)，還含有多個(gè)azol(in)es及脫水氨基酸 (Figure 1B)。它們普遍具有良好的生物活性，尤其是對多種耐藥性病原菌具有顯著的抑制活性，因此被廣泛地研究。環(huán)系不同的硫肽抑制細(xì)菌蛋白質(zhì)合成的機(jī)制也盡不相同。如29元環(huán)系的GE2270A、GE37468和thiomuracin A通過與延伸因子Tu的作用阻斷其與核糖體的結(jié)合，從而發(fā)揮活性；而26元環(huán)系的thiocillins、thiostrepton 和nosiheptide靶定于50S核糖體大亞基，結(jié)合在L11蛋白和23S RNA之間的區(qū)域，從而阻斷轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合。35元環(huán)系的sulfomycins、berninamycin和TP-1161抗菌機(jī)制與26元環(huán)硫肽相似，但是其具體的作用方式仍是不清楚的。35元環(huán)硫肽是目前發(fā)現(xiàn)的最大環(huán)系的RiPPs，其生物合成過程尚不清楚，因此中國科學(xué)院上海有機(jī)化學(xué)研究所的劉文團(tuán)隊(duì)圍繞sulfomycins展開了研究。
首先，為了鑒定sulfomycins的生物合成基因簇，作者將已被報(bào)道的環(huán)化脫水酶擴(kuò)增引物作為簡并引物對Streptomyces viridochromogene ATCC 29776進(jìn)行了PCR，成功擴(kuò)增出一條約0.75kb的DNA片段 (Psul)。基于Psul的同源重組對該基因區(qū)域進(jìn)行了失活，導(dǎo)致sulfomycins完全不再產(chǎn)生，因此證實(shí)了Psul所在基因與其生物合成相關(guān)。接著作者構(gòu)建了S. viridochromogene的cosmid文庫，并以Psul為探針進(jìn)行了篩選，成功鑒定到幾個(gè)重疊的cosmids。對pSL5001進(jìn)行了測序，其大小約為38.5kb，共含有26個(gè)orfs。序列分析表明其中16個(gè)orfs (15個(gè)結(jié)構(gòu)基因，1個(gè)自抗性基因)組成了sulfomycins的生物合成基因簇 (Figure 2A)。
類似于其他已被研究的硫肽，S. viridochromogene利用多個(gè)普遍存在的后修飾酶對前體肽SulA (54-aa)進(jìn)行加工。SulA的核心序列包含17個(gè)氨基酸，且含有多個(gè)L-Ser、L-Thr和L-Cys殘基 (i.e., SC2TTT5GC7TT9SSS12SSSSS)。后修飾過程起始于azoles的形成，推測是由sulBCDEFG六個(gè)基因編碼的蛋白催化的。這些蛋白和已知的環(huán)化脫水酶和脫氫酶組分具有序列的相似性。產(chǎn)生的線性中間體1接著被sulHI編碼的脫水酶以一種類似于LanB的機(jī)制催化Ser/Thr脫水形成雙鍵；接著由sulJ編碼的環(huán)化酶催化分子內(nèi)的[4+2]環(huán)加成，關(guān)環(huán)形成35元環(huán)系，并產(chǎn)生中心的吡啶環(huán)。剩下的五個(gè)基因sulKLMNO可能參與了后續(xù)的后修飾過程，即脫水的L-Thr4衍生化產(chǎn)生γ-羥基化的C5殘基、C末端的胺化切割、L-Gly6的羥化及后續(xù)的O-甲基化過程。整個(gè)生物合成路徑如Figure 2B所示。
六個(gè)基因sulBCDEFG參與形成了sulfomycins中五個(gè)唑環(huán)的形成，作者就這一過程展開了深入的研究。前期研究發(fā)現(xiàn)在26元和29元環(huán)硫肽生物合成過程中存在三個(gè)基因編碼了一個(gè)雙組分的環(huán)化脫水酶復(fù)合體和一個(gè)脫氫酶。其中催化形成azoline的環(huán)化脫水酶復(fù)合體包含以下兩個(gè)組分：1) Ocin-ThiF like伴侶蛋白 (F蛋白)，其N端融合了一個(gè)保守的RRE結(jié)構(gòu)域；2) 雙結(jié)構(gòu)域的蛋白，其YcaO結(jié)構(gòu)域的N端融合了一個(gè)不同的E-like結(jié)構(gòu)域，促進(jìn)與F伴侶蛋白的整合，從未實(shí)現(xiàn)該蛋白對前體肽的催化作用。而sulB和sulC分別編碼了一個(gè)F伴侶蛋白和一個(gè)雙結(jié)構(gòu)域的E1-YcaO蛋白，因此證實(shí)了經(jīng)典的環(huán)化脫水酶復(fù)合體對sulfomycins的生物合成也是至關(guān)重要的。敲除sulC的突變菌株確實(shí)不再產(chǎn)生任何產(chǎn)物。剩余的四個(gè)基因在26元或29環(huán)硫肽的生物合成過程中不存在同源蛋白，其中sulD和sulE分別編碼了單結(jié)構(gòu)域的YcaO和E1-like蛋白，sulF和sulG編碼的蛋白分別和經(jīng)典的脫氫酶N端催化結(jié)構(gòu)域和C端FMN結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源(Figure2C)。SulF包含三個(gè)結(jié)構(gòu)域，即RRE結(jié)構(gòu)域、E1-like結(jié)構(gòu)域和氧化酶結(jié)構(gòu)域，猜測其可能負(fù)責(zé)提供酶的催化活性并介導(dǎo)蛋白的整合。同樣地，分別敲除sulE、sulF和sulG均不再產(chǎn)生sulfomycins，因此證實(shí)了這三個(gè)基因也參與了35元肽骨架的生物合成。
為了研究L-Cys2、L-Thr5、L-Cys7、L-Thr9和L-Ser12是按照怎樣的順序發(fā)生環(huán)化脫水和脫氫形成五個(gè)唑環(huán)的，作者在大腸桿菌中進(jìn)行了一系列的異源表達(dá)實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明只有sulA與sulBCDEFG共表達(dá)時(shí)才能產(chǎn)生分子量減少100 Da (- 5 × [H2O+2H]) 的含有5個(gè)唑環(huán)的產(chǎn)物1 (Figure 3)。為了進(jìn)一步揭示每個(gè)蛋白的功能，作者對產(chǎn)生1的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行了點(diǎn)突變實(shí)驗(yàn)。首先對兩個(gè)YcaO相關(guān)蛋白保守的L-Glu殘基進(jìn)行了突變，得到了SulCE370A和SulDE199A突變體大腸桿菌 (Figure 3A)。結(jié)果表明這兩種突變均喪失了1的產(chǎn)生能力，其中E370A突變體積累了未修飾的SulA，揭示了YcaO蛋白的活性對后修飾的起始是必須的。SulD的E199A突變菌新產(chǎn)生了線性中間體2 (- 20 Da, -1 × [H2O+2H])和3 (- 40 Da, - 2 × [H2O+2H])。通過HR-MS/MS對其結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，證實(shí)了2中只含有一個(gè)L-Cys2來源的thioazole單元，而3的結(jié)構(gòu)中除了上述的thioazole單元，還存在一個(gè)額外的L-Thr9來源的methyloxazole。基于這些結(jié)果，作者猜測雙結(jié)構(gòu)域的E1-YcaO蛋白SulC負(fù)責(zé)第一階段L-Cys2和L-Thr9的雜環(huán)化，而另外一個(gè)獨(dú)立的YcaO蛋白SulD參與第二個(gè)階段L-Thr5、L-Cys7和L-Ser12殘基的雜環(huán)化過程。
接著在產(chǎn)生1的大腸桿菌系統(tǒng)中對兩個(gè)脫氫酶進(jìn)行了點(diǎn)突變(Figure 3B)。SulFK472A和SulFY473A突變體均不再產(chǎn)生1，而是累積了中間體4 (- 18 Da, - 1× H2O)和5 (- 36 Da, - 2 × H2O)，猜測它們分別是2和3未氧化之前的底物。SulGR62A突變體也是同樣的結(jié)果，表明了azolines到azoles的脫氫過程需要依賴FMN，并且SulF和SulG組合參與了這一過程。
為了驗(yàn)證雙結(jié)構(gòu)域E1-YcaO蛋白SulC的功能，并揭示其雜環(huán)化的殘基，作者在簡化的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中將SulA與SulBC進(jìn)行了共表達(dá)，成功地將前體肽轉(zhuǎn)化為了中間體4和5 (Figure 3B)，證實(shí)了SulB和SulC相互作用形成了環(huán)化脫水酶異源二聚體，以此來催化形成azoline。MS/MS分析表明-18 Da的中間體4中含有一個(gè)來源于L-Cys2的thioazline單元，而-36 Da的中間體5由于結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定并未分析出第二個(gè)雜環(huán)化的殘基，但是其也包含一個(gè)L-Cys2雜環(huán)化形成的thioazline單元，表明L-Cys2確實(shí)為第一個(gè)發(fā)生雜環(huán)化的殘基。碘乙酰胺衍生化實(shí)驗(yàn)表明5和4一樣，產(chǎn)生了1個(gè) + 57 Da的烷基化產(chǎn)物，表明5和4一樣包含一個(gè)游離的巰基，也就說明SulA中L-Cys7在第一階段是不發(fā)生反應(yīng)的，含羥基側(cè)鏈的L-Thr5、L-Thr9或L-Ser12可能是第二個(gè)被雜環(huán)化的殘基。
為了研究不穩(wěn)定的azoline中間體的結(jié)構(gòu)，作者設(shè)計(jì)了4和5的體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。為了形成脫氫的azole中間體2和3，需要重構(gòu)脫氫酶SulEF的活性，但是多次嘗試均未得到可溶的SulE、 SulF或SulEF共表達(dá)蛋白。這一結(jié)果表明獨(dú)立的E1-like蛋白SulE對1的產(chǎn)生的確是必不可缺的。共表達(dá)SulEFG時(shí)，成功得到了淡黃色的可溶蛋白，并證實(shí)該蛋白是一個(gè)結(jié)合了FMNH2的三成分復(fù)合物，揭示了SulE、SulF和SulG之間存在特定的整合 (Figure 4A)。SulEFG可以將5成功地轉(zhuǎn)化為-2 Da的di-azole中間體3，最終確定了5的結(jié)構(gòu)中含有一個(gè)來源于L-Thr9的methyloxazoline單元 (Figure 4B)。因此證實(shí)了第二個(gè)發(fā)生雜環(huán)化的氨基酸為L-Thr9。
為了研究第二個(gè)階段雜環(huán)化的殘基，作者對另外一個(gè)獨(dú)立的YcaO蛋白SulD的催化過程進(jìn)行了研究。為了鑒定SulD發(fā)揮活性所需要的伴侶蛋白，分別將SulD、 F蛋白SulB和E1-like蛋白SulE在大腸桿菌中表達(dá)得到了純化蛋白 (Figure 5A)。SulB或SulE與SulD共孵育均不能轉(zhuǎn)化di-azole的中間體3，表明SulD的作用方式不同于第一階段的E1-YcaO蛋白SulC。確實(shí)，當(dāng)SulD與完整的SulEFG復(fù)合體共孵育時(shí)3轉(zhuǎn)化形成了penta-azole產(chǎn)物1，伴隨著tria-zole中間體6 (- 60 Da, - 3 × [H2O+2H]) and tetra-azole中間體7 (- 80 Da, - 4 × [H2O+2H]) 的產(chǎn)生。HR-MS/MS證實(shí)了6中包含第三個(gè)來源于L-Cys7的thioazole單元，7中包含第四個(gè)來源于L-Thr5的methyloxazole單元。這些結(jié)果表明SulD通過與脫氫酶復(fù)合體SulEFG的相互作用，在第二階段連續(xù)催化L-Cys7、L-Thr5和L-Ser12形成唑環(huán)。
第二階段環(huán)化脫水酶SulD與脫氫酶復(fù)合體SulEFG的相互作用是前所未見的。作者通過等溫滴定量熱法證實(shí)了這一相互作用 (Figure 5B)。在L-Cys7、L-Thr5、和L-Ser12轉(zhuǎn)化形成唑環(huán)的過程中，SulE作為一個(gè)獨(dú)特的伴侶蛋白發(fā)揮了雙重功能：SulE作為E1-like蛋白與脫氫酶SulFG形成異源三聚體，這是通過與SulF中心的E1-like結(jié)構(gòu)域的相互作用實(shí)現(xiàn)的；通過SulE的整合，SulF上的RRE結(jié)構(gòu)域可以進(jìn)一步促進(jìn)SulD的環(huán)化脫水酶活性 (Figure 6A)。
總結(jié)來說，作者通過體內(nèi)的異源表達(dá)及體外轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)揭示了35元硫肽sulfomycins的生物合成過程(Figure 6B)。其合成分為兩個(gè)階段：第一階段由雙結(jié)構(gòu)域的E1-YcaO蛋白SulC催化，在典型的環(huán)化脫水酶二聚體SulBC的作用下依次催化L-Cys2和L-Thr9形成di-azoline中間體5，接著在脫氫酶復(fù)合物SulEFG的作用下氧化產(chǎn)生di-azole中間體3；第二階段SulEFG通過與獨(dú)立的YcaO蛋白SulD的整合形成異源四聚體，依次催化L-Cys7、L-Thr5、和L-Ser12的雜環(huán)化產(chǎn)生其他三個(gè)唑環(huán)。在SulDEFG的催化過程中并未檢測到任何azoline中間體，進(jìn)一步揭示了SulD與SulEFG復(fù)合體的緊密結(jié)合。這樣的方式在26元和29元環(huán)系的硫肽合成過程中是從未發(fā)現(xiàn)的。作者通過基因挖掘的手段證實(shí)了SulDEFG四個(gè)蛋白在35元硫肽抗生素的產(chǎn)生菌株中是普遍存在的。這一發(fā)現(xiàn)為研究含唑環(huán)的不同RiPPs的生物合成過程提供了理論依據(jù)，為促進(jìn)合成生物學(xué)生產(chǎn)新型硫肽抗生素奠定了基礎(chǔ)。
整理：Liu CL
全文鏈接：
https://doi.org/10.1021/jacs.0c02329
文章題目：
AHeterotrimeric Dehydrogenase Complex Functions with Two Distinct YcaO Proteinsto Install the Five Azole Heterocycles in
the Thirty Five-Membered Thiopeptide Antibiotics Sulfomycins
