結(jié)構(gòu)確證的方法多用多樣，但在當(dāng)今有機(jī)合成人的眼里，NMR依然是最重要、不可或缺的工具，小至有機(jī)合成的結(jié)構(gòu)表征，大至復(fù)雜天然產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)鑒定，可以說(shuō)NMR就是有機(jī)合成人員的眼睛。然而，不同技術(shù)員NMR解譜水平參差不齊，不少人還停留在通過(guò)Chemdraw或Mestrenova的NMR預(yù)測(cè)功能來(lái)研判化合物結(jié)構(gòu)的水平，結(jié)果可能會(huì)得出錯(cuò)誤的結(jié)論。
2017年，加拿大魁北克大學(xué)Steven R. LaPlante教授在Bioorg. Med. Chem. Lett.發(fā)表了題為“NMR strategies to supportmedicinal chemistry workflows for primary structure determination”的文章，詳述了各種NMR技術(shù)在有機(jī)化合物結(jié)構(gòu)解析中的應(yīng)用策略，包括區(qū)分區(qū)域異構(gòu)體和幾何異構(gòu)體，區(qū)分N-烷基類(lèi)似物和O-烷基類(lèi)似物，鑒定旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體和阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體。
作者開(kāi)篇先列舉了兩個(gè)藥物研發(fā)領(lǐng)域中結(jié)構(gòu)表征錯(cuò)誤的例子：
第一個(gè)是Bosutinib的案例。2012年，C&EN發(fā)出警告Bosutinib錯(cuò)誤的異構(gòu)體（下圖1a）正在市面出售，而該異構(gòu)體是沒(méi)有活性的。購(gòu)買(mǎi)了該化合物的科學(xué)家可能實(shí)際上收到的不是真正的分子。當(dāng)時(shí)，Bosutinib正處于治療慢性粒細(xì)胞白血病的III期臨床試驗(yàn)中，同時(shí)也作為一種酪氨酸激酶抑制劑用于醫(yī)學(xué)和基礎(chǔ)研究。據(jù)Bosutinib供應(yīng)商透露，銷(xiāo)售錯(cuò)誤異構(gòu)體的公司高達(dá)80%，當(dāng)時(shí)，用SciFinder搜索bosutinib可產(chǎn)生300多個(gè)結(jié)果，可以說(shuō)，全世界的研究工作可能因此而無(wú)效。以牛津大學(xué)為例，研究人員從購(gòu)買(mǎi)的假Bosutinib的日期表明，至少?gòu)?006年以來(lái)，這種不正確的異構(gòu)體一直在商業(yè)中使用，直到6年后才發(fā)現(xiàn)。最終調(diào)查結(jié)果是合成中使用了錯(cuò)誤的苯胺原料，3,5-二氯-4-甲氧基苯胺（1c）代替了正確的2,4-二氯-5-甲氧基苯胺（1d）。C&EN指出，這兩個(gè)化合物的質(zhì)譜和元素分析是完全一樣的，雖然兩個(gè)化合物氫譜的芳環(huán)信號(hào)有所差異，但是如果不將這兩個(gè)化合物對(duì)比分析很難發(fā)現(xiàn)問(wèn)題。
圖片來(lái)源：Bioorg. Med. Chem. Lett.
第二個(gè)例子則是關(guān)于誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的化合物TIC10。這個(gè)化合物于1973年和2013年被兩個(gè)不同的公司申請(qǐng)了專(zhuān)利。隨后當(dāng)Scripps研究所人員在研究這個(gè)化合物時(shí)發(fā)現(xiàn)他們制備的化合物居然沒(méi)有活性，而從國(guó)家癌癥研究所（NCI）庫(kù)中獲得的TIC10給出了預(yù)期的陽(yáng)性結(jié)果。經(jīng)過(guò)仔細(xì)分析后發(fā)現(xiàn)，被兩個(gè)公司先后申請(qǐng)專(zhuān)利的化合物2a沒(méi)有活性，有活性的化合物是其異構(gòu)體2b。
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咱們接下來(lái)就按照原文作者的思路學(xué)習(xí)一下什么情況下該用什么NMR實(shí)驗(yàn)鑒定結(jié)構(gòu)。
區(qū)域異構(gòu)（Regioisomerism）
區(qū)域異構(gòu)產(chǎn)物僅通過(guò)LC-MS和/或1H-NMR 是很難區(qū)分的，而利用HMQC（HSQC）和HMBC可清楚地表征。在化合物3a中，酯部分位于原子2的間位。在HMBC光譜中，觀察到H2/C1與原子2的具有唯一低場(chǎng)相關(guān)性。未觀察到H2/C3交叉峰。這與化合物3a的結(jié)構(gòu)一致。對(duì)于化合物3b，酯部分與C2 鄰位，并且在HMBC光譜中觀察到原子2的兩個(gè)低場(chǎng)交叉峰（H2/C1和H2/C3）。
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與所有實(shí)驗(yàn)方法一樣，HMBC實(shí)驗(yàn)也有缺點(diǎn)。貫穿鍵的耦合常數(shù)會(huì)發(fā)生很大變化，從而很難區(qū)分 3JH,C和 2JH,C。 3JH,C耦合常數(shù)除其他因素外，還取決于二面角，并且當(dāng)二面角接近90°時(shí)，顯然不存在交叉峰。因此，在全面分析中必須考慮不存在峰。
另外，作者認(rèn)為2D-NMR實(shí)驗(yàn)中的ROESY實(shí)驗(yàn)對(duì)于闡明結(jié)構(gòu)很有價(jià)值，因?yàn)樗梢蕴峁┝?span style="max-width: 100%; color: rgb(62, 62, 62); font-family: 微軟雅黑, "microsoft yahei"; text-indent: 28px; box-sizing: border-box !important; overflow-wrap: break-word !important;">分子內(nèi)空間距離在5埃之內(nèi)的氫原子信息。區(qū)域異構(gòu)體4a和4b的區(qū)別僅在于它們?cè)诘s苯并咪唑基部分上的連接點(diǎn)。從1H和ROESY NMR數(shù)據(jù)觀察，一個(gè)可以識(shí)別的H2/H1和H2/H6相關(guān)性，與化合物一致4a。另一個(gè)可以識(shí)別H4/H1和H4/H6交叉峰，與化合物4b的結(jié)構(gòu)一致。
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幾何異構(gòu)（Geometric Isomerism）
幾何異構(gòu)體（E/Z）常見(jiàn)于含雙鍵化合物當(dāng)中。通過(guò)耦合常數(shù)即可判別，順式耦合常數(shù)通常在3–13Hz和反式在12–20 Hz 。當(dāng)雙鍵上的氫原子和其他原子存在耦合時(shí)會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)共振多重峰，這時(shí)需要共振去耦，藍(lán)色圖譜是選擇性去耦之后的氫譜。對(duì)于化合物5a，順式異構(gòu)體的1 H NMR光譜顯示H2與H1質(zhì)子和H3耦合而成為多重峰。另一方面，H3被與H5的重疊所遮蓋。由于這一障礙，無(wú)法確定3JH3,H2，但是，通過(guò)有選擇地將H1解耦（右），質(zhì)子H2簡(jiǎn)化為一個(gè)雙峰，從中可以導(dǎo)出與H3的耦合（3JH3,H2 = 9.8 Hz），與順式異構(gòu)體一致。對(duì)于化合物5b，H3與H4偶聯(lián)。去耦后，從中可以提取出與H2的大耦合，3JH3,H= 15.2 Hz，與反式異構(gòu)體一致。
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旋轉(zhuǎn)異構(gòu)/阻轉(zhuǎn)異構(gòu)（Rotamers/Atropisomers）
旋轉(zhuǎn)異構(gòu)是由于化合物受空間因素，電子效應(yīng)，氫鍵等因素沿單鍵旋轉(zhuǎn)受限或環(huán)翻轉(zhuǎn)受阻而產(chǎn)生的。如果旋轉(zhuǎn)/翻轉(zhuǎn)的障礙大于20 kcal / mol，則會(huì)產(chǎn)生手性，從而形成阻轉(zhuǎn)異構(gòu)體。小于20 kcal /mol會(huì)導(dǎo)致旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體（共聚體）出現(xiàn)。旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體無(wú)法通過(guò)LC方法分離。遇到這種情況，作者提供了常見(jiàn)的解決辦法：變溫（VT）以及ROESY。作者以三級(jí)酰胺的NMR變溫實(shí)驗(yàn)和ROESY實(shí)驗(yàn)為例介紹了這種旋轉(zhuǎn)異構(gòu)體的NMR信號(hào)特點(diǎn)。
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N-烷基化和O-烷基化（N- vs. O-Alkylation）
烷基化反應(yīng)通常導(dǎo)致不可預(yù)測(cè)的O-和N- 烷基類(lèi)似物。采用13 C化學(xué)位移可區(qū)分由環(huán)境性配體形成的N-與O-烷基化產(chǎn)物。如下圖，在N-烷基化類(lèi)似物中，13 C位移下降至46.8ppm， 而在O-類(lèi)似物中，信號(hào)出現(xiàn)在68.9ppm處 。
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立體化學(xué)異構(gòu)體（Stereoisomerism）
確定手性分子的絕對(duì)構(gòu)型最簡(jiǎn)便的就是X射線衍射。另一方面，ROESY也是確定手性化合物立體化學(xué)的非常實(shí)用的方法。對(duì)于化合物9觀察到脯氨酸環(huán)平面上方的氫原子彼此之間具有強(qiáng)的ROESY峰，而與脯氨酸平面下方的氫原子相比具有較弱的峰。交叉峰2/3的尺寸小于2'/3的尺寸。觀察到了尖峰1/2'和2/4，但沒(méi)有觀察到1/2和2'/ 4。5/5'是重疊的，不能用作距離比較，但是2和2'很好地分離了。該數(shù)據(jù)證實(shí)立體化學(xué)如圖9 所示。
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文末，作者總結(jié)了一個(gè)超級(jí)實(shí)用的表格告訴大家什么情況應(yīng)該用哪種NMR技術(shù)。
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