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有機(jī)磷農(nóng)藥(organophosphorus pesticides, OPs)由于具有成本低，合成簡(jiǎn)便，對(duì)害蟲防治活性高等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)中使用最廣泛的殺蟲劑。因此，它的檢測(cè)是一個(gè)日益嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。作為乙酰膽堿酯酶(AChE，一種關(guān)鍵的神經(jīng)系統(tǒng)酶)的底物類似物，OPs通過抑制AChE催化乙酰膽堿(ACh)水解發(fā)揮其毒性作用，導(dǎo)致ACh的過度積累從而引起膽堿毒性。

在過去的幾十年中，已經(jīng)建立了如液相色譜(LC)、氣相色譜(GC)和質(zhì)譜(MS)等方法檢測(cè)低濃度的OPs，但是這些方法的儀器昂貴，處理步驟繁瑣，分析速度慢，在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中受到限制。目前，一種簡(jiǎn)單有效的檢測(cè)OPs的策略是使用基于酶的方法，該方法響應(yīng)速度快，但由于酶易受環(huán)境影響，穩(wěn)定較差。隨著納米技術(shù)的進(jìn)步，研究者嘗試將AChE固定在納米材料上以開發(fā)具有低檢測(cè)限，快速響應(yīng)和穩(wěn)定性好的檢測(cè)OPs的生物傳感器。

石墨烯作為一種二維(2D)材料，具有較高的表面積、電子遷移率、導(dǎo)熱性和機(jī)械強(qiáng)度，最近報(bào)道的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)還具有類過氧化物酶的活性，使其成為生物分析中天然酶的有效替代品。然而，很少有報(bào)道使用GO的內(nèi)在類過氧化物酶活性來靈敏地檢測(cè)OPs。

近日，吉林大學(xué)羅全教授與劉俊秋教授共同在《Nanoscale》發(fā)表了題為“Graphene oxide-based colorimetric detection of organophosphorus pesticides via a multi-enzyme

cascade reaction”的研究論文。在該研究中，作者將合成的尺寸可調(diào)的氧化石墨烯(graphene oxides, GO)作為辣根過氧化物酶(HRP)模擬物，用于通過級(jí)聯(lián)反應(yīng)比色檢測(cè)納摩爾濃度的有機(jī)磷農(nóng)藥(OPs)。這種基于GO比色法檢測(cè)OPs的方法具有高靈敏度和穩(wěn)定性，在公共衛(wèi)生應(yīng)用領(lǐng)域具有巨大潛力。

示意圖為通過多酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)對(duì)OPs進(jìn)行比色分析的原理圖。其中BA表示甜菜堿醛；oxTMB表示氧化的TMB。作者首先使用改進(jìn)的Hummers方法制備尺寸可調(diào)的GO。該多酶級(jí)聯(lián)方法需要三種酶：AChE、膽堿氧化酶(choline oxidase，CHO)和GO依次起作用，其中AChE/CHO可以催化ACh和膽堿形成H₂O₂，從而激活GO將3,3,5,5-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)轉(zhuǎn)變成藍(lán)色產(chǎn)物。OPs對(duì)AChE的抑制作用導(dǎo)致H₂O₂產(chǎn)量急劇下降，導(dǎo)致視覺上顏色強(qiáng)度的變化，從而可以識(shí)別出各種低含量的OPs(例如樂果，甲基對(duì)氧磷和毒死蜱)。

圖一為通過改進(jìn)的Hummers方法合成的GO-1和GO-2片層的AFM(a和b)和TEM(c和d)圖像。

AFM圖像表明，GO-1的平均直徑只有幾微米，厚度為1.4-2.1 nm (圖1a)，比單層石墨烯(0.7-1 nm)厚約2-3倍。相比之下，剝落的GO-2薄片比GO-1小得多。圖1b顯示的是高度為0.8-1.7 nm的納米片的形成，對(duì)應(yīng)于1-2層的石墨烯結(jié)構(gòu)。TEM圖像進(jìn)一步表明，GO-1具有5-10 μm的細(xì)皺紋結(jié)構(gòu)，而GO-2具有更不規(guī)則的形狀，尺寸分布為100-200 nm(圖1c-d)。這些結(jié)果與AFM數(shù)據(jù)一致，表明GO片層的尺寸可以通過合成條件輕松控制，利于后續(xù)基于酶方法的檢測(cè)。

圖二為GO-1(a和c)和GO-2(b和d)的全掃描X射線光電子能譜(XPS)和高分辨率C 1s能譜。由于先前有關(guān)碳納米材料催化機(jī)理的報(bào)道表明，GO的HRP活性高度依賴于其功能性氧基團(tuán)(-C=O和O=C-O-基團(tuán))。因此，作者首先通過XPS分析來測(cè)量?jī)蓚€(gè)GO片層的化學(xué)狀態(tài)。如圖2a和2b所示，在XPS光譜中觀察到了285和533 eV處的兩個(gè)強(qiáng)烈峰，這表明GO-1和GO-2具有相同的C和O主元素。XPS C 1s光譜可以進(jìn)一步分解為三個(gè)不同的峰，其結(jié)合能分別為284.6 eV，286.6 eV和288.6 eV，分別對(duì)應(yīng)于C=C/C-C，C-O和C=O鍵的峰。

圖三 (a)在不存在或存在GO納米片的情況下，TMB/H₂O₂反應(yīng)溶液在652 nm處的時(shí)間依賴性吸收曲線；(b) GO-2在0至18 μg mL^-1的濃度范圍內(nèi)具有劑量依賴活性；(c)和(d)分別為用于GO催化的最佳pH和溫度探索。由于GO具有類過氧化物酶活性，作者首先使用TMB-H₂O₂系統(tǒng)，通過652 nm處TMB的吸光度變化來評(píng)估GO-1和GO-2的活性。圖3a顯示了在含0.4 mM TMB和50 mM H₂O₂的pH 4.0 HAc-NaAc緩沖液中，有或沒有GO時(shí)溶液隨時(shí)間的吸光度變化。結(jié)果表明，單獨(dú)的H₂O₂幾乎不能氧化TMB引起顯著的顏色變化，而加入GO納米片后，該反應(yīng)顯著加速，且相較于單獨(dú)的GO-1，GO-2具有更高的HRP活性。圖3b的結(jié)果表明，GO-2的反應(yīng)速率隨其濃度的增加而增加，活性顯示出劑量依賴性。此外，作者還研究了pH，溫度和H₂O₂濃度對(duì)GO相對(duì)活性的影響。在pH 4.0時(shí)，GO擁有最大的相對(duì)活性(圖3c)，最佳溫度為35°C (圖3d)。

圖四 (a) GO-2/AChE/CHO介導(dǎo)的將TMB氧化為藍(lán)色oxTMB的反應(yīng)；(b)用于基于GO比色分析AChE的劑量依賴性曲線；(c-e)為OP檢測(cè)的劑量反應(yīng)曲線和半對(duì)數(shù)圖(插圖)，其中，圖c-e分別對(duì)應(yīng)于檢測(cè)樂果、甲基對(duì)氧磷和毒死蜱。圖4a結(jié)果表示，在沒有OPs的情況下，GO-2/AChE/CHO/TMB系統(tǒng)顯示深藍(lán)色，而在其余兩種系統(tǒng)中均未觀察到明顯的顏色變化，表明AChE/CHO催化反應(yīng)釋放H₂O₂導(dǎo)致GO-2催化TMB氧化。圖4b結(jié)果表示，反應(yīng)溶液的顏色強(qiáng)度與AChE的濃度有關(guān)，表明該實(shí)驗(yàn)可通過抑制AChE活性，基于比色法檢測(cè)殘留的OPs。對(duì)樂果、甲基對(duì)氧磷和毒死蜱的檢測(cè)限分別為2、1和2 ppb (ng mL^-1)。

作者開發(fā)了一種基于GO的比色法用于OPs的靈敏檢測(cè)。結(jié)果表明，該方法檢測(cè)樂果、甲基對(duì)氧磷和毒死蜱的相應(yīng)LOD低于2 ppb，均低于中國(guó)國(guó)家食品安全標(biāo)準(zhǔn)采用的最大殘留限量。此外，該檢測(cè)可以在40分鐘內(nèi)完成，對(duì)濃度在1–200 ng mL^-1范圍內(nèi)的OP具有線性響應(yīng)(R²值超過0.99)，顯示了其對(duì)農(nóng)藥殘留進(jìn)行定量分析的巨大潛力。

羅全教授，2009年畢業(yè)于吉林大學(xué)理化所，獲理學(xué)博士學(xué)位。同年，加入超分子結(jié)構(gòu)與材料國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室任講師，2012年晉升為副教授，2018年晉升為教授。2015-2016年在美國(guó)明尼蘇達(dá)大學(xué)化學(xué)系做訪問研究。主要研究興趣包括計(jì)算生物與分子模擬，仿生催化與組裝，生物超分子功能材料等，相關(guān)成果在Chem. Rev.，Angew. Chem. Int. Ed.，ACS Catal.，ACS Appl. Mat. Inter.等國(guó)際SCI刊物上發(fā)表論文30余篇，累計(jì)他引674次。近年來，主持國(guó)家自然科學(xué)面上基金2項(xiàng)，青年基金1項(xiàng)，以及3項(xiàng)省科技廳重點(diǎn)研發(fā)項(xiàng)目/面上基金/青年基金，并獲吉林大學(xué)優(yōu)青培育計(jì)劃和優(yōu)秀青年教師培養(yǎng)計(jì)劃等項(xiàng)目支持。

研究興趣：

1.計(jì)算生物與分子模擬

2.仿生催化與組裝

3.生物超分子功能材料

劉俊秋教授，1987年畢業(yè)于吉林大學(xué)化學(xué)系，1999年在吉林大學(xué)化學(xué)系高分子專業(yè)分別獲理學(xué)碩士和博士學(xué)位。2002-2003年獲洪堡基金資助在德國(guó)從事博士后研究。2004年獲吉林省“首批拔尖創(chuàng)新人才”稱號(hào)，同年入選教育部“新世紀(jì)優(yōu)秀人才培養(yǎng)計(jì)劃”。2005入選吉林省創(chuàng)新人才工程。2010年獲得吉林省有突出貢獻(xiàn)的中青年專業(yè)技術(shù)人才稱號(hào)。2011年被評(píng)選為吉林省高級(jí)專家。主持或參加了多項(xiàng)國(guó)家863、973、自然基金重點(diǎn)研究項(xiàng)目等。近年來在Chem. Review, Chem. Soc. Review，Acc. Chem. Res.，J. Am. Chem. Soc.，Angew. Chem. Int. Ed等雜志已發(fā)表SCI研究論文150余篇，獲得吉林省科技進(jìn)步一等獎(jiǎng)1項(xiàng)(排名第一)。

研究興趣：

1.仿硒酶工程研究

2.超分子仿酶研究

3.蛋白質(zhì)組裝與功能化

原文鏈接：https://doi.org/10.1039/C9NR10862A

DOI: 10.1039/c9nr10862a

編輯：周一黨

審核：CK

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