眾所周知，液相色譜中流動(dòng)相的選擇非常重要，直接影響到色譜分離的結(jié)果。然而對(duì)于反相色譜流動(dòng)相的選擇中，大家的關(guān)注點(diǎn)幾乎都是在緩沖鹽的選擇上，對(duì)于有機(jī)相的選擇關(guān)注的往往很少，幾乎都是甲醇乙腈隨機(jī)使用。主要是反相液相色譜中可選的有機(jī)相種類不多，絕大多數(shù)都是甲醇，乙腈再加上少部分用四氫呋喃。而實(shí)際上，有機(jī)相的選擇也非常重要，那我們應(yīng)該如何選擇，是甲醇還是乙腈，還是其他？
有機(jī)相的選擇，首先考慮的是溶劑的強(qiáng)度和極性。溶劑的強(qiáng)度決定著化合物洗脫需要有機(jī)溶劑的量，在反相色譜中隨著溶劑極性的增大而減小。我們常用的幾種有機(jī)溶劑的溶劑強(qiáng)度分別為：甲醇2.64，乙腈3.12，四氫呋喃4.4，從數(shù)值來(lái)看幾種有機(jī)溶劑的洗脫能力甲醇<乙腈<四氫呋喃，具體對(duì)應(yīng)起來(lái)如下圖所示：
從上圖中可知，如果某一化合物能在20%乙腈水的條件下洗脫下來(lái)，如果將乙腈換成甲醇，則需約28%甲醇水才能洗脫，而換成四氫呋喃，則只需15%的四氫呋喃就能洗脫。
Tips：上述只是理論上的數(shù)據(jù)，在實(shí)際實(shí)驗(yàn)中，如果需達(dá)到相似的保留，將乙腈更換成甲醇，我們建議在上圖的基礎(chǔ)上，額外增加10%甲醇；而將乙腈更換成四氫呋喃時(shí)，則需減少5%四氫呋喃。
從三種溶劑的結(jié)構(gòu)上看，甲醇在氫鍵作用下既是強(qiáng)的質(zhì)子給予體又是強(qiáng)的質(zhì)子接受體；乙腈具有偶極作用，在氫鍵作用下，又是非常弱的質(zhì)子接受體；四氫呋喃在氫鍵作用下只能接受質(zhì)子，不能給予質(zhì)子。
色譜柱：苯基柱 150*4.6mm 5um
流動(dòng)相：20mM磷酸二氫鉀（pH 2.5）: 有機(jī)相%（圖示）
流速：1.0ml/min
檢測(cè)波長(zhǎng)：UV@220nm
化合物：1. 糖精鈉 2. 對(duì)羥基苯甲酸 3. 山梨酸 4. 脫氫乙酸 5.對(duì)羥基苯甲酸甲酯
如上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果所示，在使用乙腈和甲醇分別作為洗脫溶劑的時(shí)候，出峰順序發(fā)生了變化。通過結(jié)構(gòu)來(lái)看，糖精鈉是一個(gè)強(qiáng)的質(zhì)子接受體，而苯甲酸是一個(gè)強(qiáng)的質(zhì)子給予體，在甲醇做流動(dòng)相的時(shí)候，甲醇既是一個(gè)強(qiáng)的質(zhì)子接受體又是一個(gè)強(qiáng)的質(zhì)子給予體，作用互相抵消，他們的洗脫是純粹依靠甲醇本身的洗脫能力；而乙腈只是一個(gè)弱的質(zhì)子接受體，不能給予質(zhì)子，相比之下乙腈與苯甲酸之間還多了一層氫鍵作用，因此，苯甲酸在乙腈中的洗脫更快，導(dǎo)致出峰順序發(fā)生了變化。脫氫乙酸和對(duì)羥基苯甲酸甲酯這兩種物質(zhì)，相比而言，對(duì)羥基苯甲酸甲酯帶有苯環(huán)，而乙腈中的π電子干擾了它與苯基固定相的結(jié)合，因此出峰更快，出峰順序也發(fā)生了變化。
Tips：在用苯基柱時(shí)，使用甲醇做有機(jī)相，能更好的體現(xiàn)苯基的π-π選擇性。同時(shí)還可以根據(jù)目標(biāo)化合物接受或給予質(zhì)子的能力，挑選合適的溶劑作為流動(dòng)相，能夠取得意想不到的分離效果。
除此之外，溶劑的粘度，紫外吸收截止波長(zhǎng)也是我們選擇有機(jī)相需要考慮的內(nèi)容。
溶劑的粘度影響著儀器系統(tǒng)的壓力，混合溶劑粘度越大，壓力越大。上圖中列出了幾種常用有機(jī)溶劑與水混合時(shí)的粘度曲線，四氫呋喃與水混合的粘度曲線與甲醇類似。Tips：在使用小粒徑和小內(nèi)徑的色譜柱時(shí)，更傾向于選擇乙腈作為有機(jī)相，壓力偏低。
常見溶劑的紫外吸收截止波長(zhǎng)
| 有機(jī)溶劑 | 紫外吸收截止波長(zhǎng)/nm |
|---|---|
| 甲醇 | 205 |
| 乙腈 | 190 |
| 異丙醇 | 210 |
| 乙醇 | 210 |
| 四氫呋喃 | 220 |
| DMF | 270 |
使用紫外檢測(cè)器時(shí)，當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)低于溶劑截止波長(zhǎng)時(shí)就會(huì)生產(chǎn)較大干擾。
Tips：當(dāng)波長(zhǎng)在200nm左右時(shí)，乙腈的吸收要遠(yuǎn)低于甲醇等其他溶劑，尤其是在梯度運(yùn)行的時(shí)候，使用乙腈作為流動(dòng)相，基線漂移也會(huì)遠(yuǎn)小于甲醇，這樣得到的色譜圖不僅美觀，樣品的檢測(cè)限和方法的靈敏度也要好很多。
