Paraherquamide天然產(chǎn)物家族包含多種從青霉菌屬中分離的代謝產(chǎn)物，有潛在的抗寄生蟲活性，多種paraherquamide的類似物被合成，用于提高其藥效。其生物合成路徑包含分子內(nèi)DA反應(yīng)、不常見的氧化取代和螺環(huán)氧化吲哚(spiro-oxindole)的形成，賦予該物質(zhì)生物活性。
Paraherquamide屬于真菌吲哚生物堿家族，包含雙環(huán)[2.2.2]二雜辛烷(bicyclo[2.2.2]diazaoctane)環(huán)系，通過分子內(nèi)DA反應(yīng)合成。螺環(huán)是眾多天然產(chǎn)物的功能基團，合成螺環(huán)的酶被認為參與到吲哚C2=C3的環(huán)氧化中，具有面選擇性，可以控制環(huán)氧化物的開環(huán)。圖1中NotB催化notoamide E的2,3-β面環(huán)氧化，生成非螺環(huán)產(chǎn)物；這條反應(yīng)路徑中，另一種黃素依賴單氧化酶(Flavin-dependent monooxygenase) NotI催化stephacidin A的2,3-α面環(huán)氧化生成notoamide B.黃素依賴單氧化酶可以在分子內(nèi)DA反應(yīng)前后進行環(huán)氧化，導致notoamide合成中的多變性。
圖1 螺環(huán)氧化吲哚的生成及面選擇性模型
隨著對映選擇性環(huán)氧化和螺環(huán)化合成方法的快速增長，生物催化在此類合成問題中的角色也正在被認識。酶的內(nèi)稟選擇性在合成化學中無可匹敵，伴隨每個酶促反應(yīng)的發(fā)現(xiàn)，生物合成的工具箱變得更加充實。特別是一些氧化酶可用于生成全合成起始物的對映選擇性純品。因此探索酶促環(huán)氧化和螺環(huán)化反應(yīng)中僅有的幾個酶是非常重要的。
本文探究的黃素依賴單氧化酶PhqK在圖2的代謝途徑中負責氧化Paraherquamide K和L生成Paraherquamide M和N，其機理與之前假設(shè)相同，即吲哚的α-環(huán)氧化，環(huán)氧C3開環(huán)產(chǎn)生C2羥基碳正離子，最后prenyl基團從C2遷移到C3產(chǎn)生2-氧化吲哚。本文第一次提供了此類螺環(huán)黃素單氧化酶的結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)，闡明了環(huán)氧化合物的生成和Pinacol重排中生物催化的控制方式。
圖2 黃素依賴單氧化酶PhqK參與的吲哚生物堿生物paraherquamide合成路徑
圖3 PhqK催化非天然底物的反應(yīng)
作者獲取了單氧化酶PhqK的晶體結(jié)構(gòu)以及Paraherquamide K，Paraherquamide L，非天然底物 monochlorinated malbrancheamide B和monobrominated malbrancheamide C與PhqK復合物的晶體結(jié)構(gòu)(見圖3反應(yīng))。觀察晶體結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)底物和輔酶FAD的結(jié)合口袋被一條長通道相連，如圖4。
圖4 不含底物的PhqK以及與Paraherquamide K (14)，Paraherquamide L (15)結(jié)合的PhqK的晶體結(jié)構(gòu)，可見底物與FAD之間的通道
黃素依賴單氧化酶的輔酶通常是動態(tài)的，其構(gòu)象取決于底物結(jié)合狀態(tài)和FAD的氧化態(tài)。在結(jié)合底物和無底物的PhqK晶體中，黃素采取 out 構(gòu)象；黃素的還原可以誘導出 in 構(gòu)象。作者未得到還原態(tài)FAD與蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，但通過包含 in 構(gòu)象的單氧化酶HpxO同源模建出了 in 構(gòu)象PhqK的結(jié)構(gòu)。out 構(gòu)象PhqK和 in 構(gòu)象可以較好重合，后者C4a-OOH-FAD與底物距離相對前者明顯縮短至6.5埃，如圖5。
圖5 底物14和15與 in 構(gòu)象FAD(薰衣草色)和 out 構(gòu)象FAD(橘色)的相對位置
觀察發(fā)現(xiàn)底物Paraherquamide L在PhqK中采取α-氧化的取向，與另一底物的結(jié)合方式不同，如圖6。1500 ns分子模擬發(fā)現(xiàn)Paraherquamide L在催化口袋中更加剛性，而Paraherquamide K相對柔性，利于環(huán)氧化的構(gòu)象(productive conformation)少，這與觀察到Paraherquamide L的反應(yīng)活性更高相吻合。定點突變實驗發(fā)現(xiàn)Gln232，Arg192和Asp47是關(guān)鍵殘基，均與底物吲哚N-H接觸。Arg192與 in 構(gòu)象的黃素沖突，說明Arg192會伴隨著FAD的擺動而一同運動。作者認為Arg192可以接近環(huán)氧化后的底物并傳遞質(zhì)子實現(xiàn)開環(huán)，雖然Arg192距吲哚C2為7埃，但其側(cè)鏈完全舒展時可以充分接近底物。PROPKA分析Arg192發(fā)現(xiàn)在底物和蛋白運動到催化構(gòu)象時(Arg192接近底物) 其側(cè)鏈pKa減小。作者認為蛋白質(zhì)背景可以降低Arg192側(cè)鏈質(zhì)子酸性實現(xiàn)環(huán)氧化合物的質(zhì)子化開環(huán)。
圖6 左：兩種底物的重疊比較；中：Paraherquamide L的剛性構(gòu)象與 in 構(gòu)象的FAD；右：Arg192和FAD間的沖突
分子模擬完成后，作者進行了DFT計算研究。如圖7，選取包含多種取代基的吲哚片段和胍基代替Arg192，作者研究了C2羥基遷移的Route1和C3遷移的Route2。C6有供電子的OMe取代時能穩(wěn)定C2-羥基碳正離子，而C3-羥基碳正離子不被穩(wěn)定，因此Route1比Route2有利。
圖7 簡單模型下環(huán)氧化合物開環(huán)的兩種反應(yīng)路徑
如圖8，碳鍵的遷移是模型反應(yīng)的決速步，在酸的存在下，可以顯著降低Route1的能壘6.5 kcal/mol, 降低Route2的能壘3.9 kcal/mol。雖然兩條路徑能壘均有下降，但Route1仍是優(yōu)勢路徑。上述結(jié)果說明實驗觀察到的螺環(huán)氧化吲哚產(chǎn)物是分子自身的重排傾向，酶PhqK的作用是通過酸性殘基催化降低1,2-遷移的能壘。
圖8 酸對環(huán)氧開環(huán)重排的決速步能壘影響
