為大家分享一篇發(fā)表在J. Am. Soc. Mass Spectrom.上的文章，Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry1，該文章的通訊作者是來自美國(guó)ExSAR公司的Yoshitomo Hamuro教授。
氫氘交換質(zhì)譜（HDX-MS）是一種描述蛋白質(zhì)動(dòng)力學(xué)的強(qiáng)大方法，主要應(yīng)用于研究蛋白質(zhì)表征、工藝優(yōu)化、蛋白質(zhì)突變的結(jié)構(gòu)效應(yīng)、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/小分子相互作用等，酶學(xué)、質(zhì)譜技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法的進(jìn)步使HDX-MS能夠?qū)崿F(xiàn)更高的分辨率。本研究著重于分析HDX-MS的化學(xué)過程，前半部分使用pKa值和質(zhì)子轉(zhuǎn)移理論推導(dǎo)了蛋白質(zhì)中各個(gè)官能團(tuán)的HDX速率，后半部分描述了影響主鏈酰胺氫交換速率的各種參數(shù)。
一、各官能團(tuán)的HDX速率
氫氘交換反應(yīng)由氫轉(zhuǎn)移反應(yīng)和氘轉(zhuǎn)移反應(yīng)組成，酸催化過程中先在目標(biāo)官能團(tuán)上加一個(gè)氘，再去除一個(gè)氫質(zhì)子，堿催化過程中先在目標(biāo)官能團(tuán)上去除一個(gè)氫質(zhì)子后再加氘，氘水催化的過程則都有可能。根據(jù)公式1一旦確定了二階速率常數(shù)且只考慮以上三種催化時(shí)，可以通過公式2獲得一階HDX反應(yīng)速率常數(shù)kch。其中在較低pH下，由于氨基質(zhì)子化，應(yīng)考慮到來自氨基的質(zhì)子或氘轉(zhuǎn)移反應(yīng)；在較高pH下，由于去質(zhì)子化，羧基等官能團(tuán)對(duì)或氘轉(zhuǎn)移反應(yīng)影響不大。
接著，作者用質(zhì)子轉(zhuǎn)移理論估計(jì)了羥基、巰基、酚羥基、氨基、咪唑基、羧基、胍基、吲哚基團(tuán)的HDX速率，并與實(shí)際觀測(cè)數(shù)據(jù)進(jìn)行了比較（圖2）。
公式3. 根據(jù)Linderstr?m?Lang模型推導(dǎo)出的EX1、EX2模型中交換速率常數(shù)公式，其中Kapp為觀察到的交換速率，Kop為蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)打開常數(shù)，kch為化學(xué)氫氘交換速率。
公式4. 用吉布斯自由能ΔGop表示打開常數(shù)Kop。
側(cè)鏈、pH和溫度會(huì)影響HDX過程。側(cè)鏈效應(yīng)對(duì)EX2時(shí)計(jì)算自由能ΔGop具有很大影響，通常酰胺的C端側(cè)鏈比N端側(cè)鏈的作用稍強(qiáng)；龐大的疏水氨基酸（如Ile、Val和Leu）會(huì)降低HDX速率，也會(huì)更好的保護(hù)氘不被交換回去；極性氨基酸（如Cys、His、Asn和Ser）會(huì)加快HDX速率，但在回交時(shí)不能很好地保護(hù)氘，尤其當(dāng)夾在兩個(gè)His殘基之間時(shí)。對(duì)此，Englander, S.W等人的最新成果提供了軟件來計(jì)算側(cè)鏈效應(yīng)2。
N、C末端對(duì)解析HDX-MS數(shù)據(jù)以實(shí)現(xiàn)高分辨率十分重要，由于主鏈酰胺氫在淬滅時(shí)會(huì)以各自的速率失去氘，當(dāng)?shù)鞍妆幻附鉃殡亩螘r(shí)會(huì)引入許多新的N、C末端以及不同的回交率。最明顯的末端效應(yīng)是在淬滅條件下，肽的第一個(gè)酰胺氫的交換速度明顯快于其余的主鏈酰胺氫，故通常假定肽的第一酰胺在淬滅過程中不保留氘，當(dāng)N端氨去質(zhì)子化時(shí)這種N端效應(yīng)消失。但是當(dāng)前兩個(gè)殘基中的一個(gè)或兩個(gè)是大分子氨基酸（如Ile，Val和Leu）時(shí)，第一個(gè)酰胺上的氘不可忽略。與N末端相反，C末端的羧酸根基團(tuán)使堿催化的氫交換反應(yīng)減速，肽的最后一個(gè)酰胺氫的交換可能比其余主鏈酰胺氫的交換慢，當(dāng)最后兩個(gè)殘基包括His、Asp、Cys、Gly、Glu、Ser和Glu時(shí)，可能會(huì)突出此影響。
pH影響HDX分析的各個(gè)方面，因?yàn)橹麈滜０窔浠瘜W(xué)交換反應(yīng)主要是酸或堿催化反應(yīng)。溶劑影響主要在LC分離過程中突顯出，添加有機(jī)溶劑后，堿催化反應(yīng)的二級(jí)氫交換速率可能不會(huì)發(fā)生太大變化，酸催化反應(yīng)的二級(jí)氫交換速率可能會(huì)略有變化，但由于反應(yīng)機(jī)理復(fù)雜，很難在添加有機(jī)溶劑時(shí)精確估算。氫同位素的類型也會(huì)對(duì)主鏈酰胺氫交換速率有輕微影響（圖3）。
綜上，本文介紹了用于蛋白質(zhì)的氫氘交換質(zhì)譜所涉及的化學(xué)內(nèi)容。首先使用質(zhì)子轉(zhuǎn)移理論和pKa值估算了蛋白質(zhì)中所有類型的雜原子氫的速率，估算的HDX速率與大多數(shù)官能團(tuán)的觀測(cè)值非常吻合（吲哚和酰胺基除外，差異由反應(yīng)機(jī)理解釋）。其次討論了影響主鏈酰胺氫HDX速率的因素，包括側(cè)鏈、N/C末端、pH、溫度、有機(jī)溶劑和同位素，這些因素對(duì)正確設(shè)計(jì)交換反應(yīng)和下游過程，以及對(duì)HDX-MS數(shù)據(jù)的分析和解釋十分重要。
文章引用：Hamuro,Y., Tutorial: Chemistry of Hydrogen/Deuterium Exchange Mass Spectrometry. Journal of the American Society for MassSpectrometry 2021, 32 (1), 133-151.
