Formicamycins和fasamycins是典型的聚酮類(lèi)天然產(chǎn)物，具有顯著的抗菌活性。本文揭示fasamycins需兩步途徑(擴(kuò)環(huán)與縮環(huán))轉(zhuǎn)化為formicamycins，涉及兩個(gè)基因，forX和forY。敲除forX，只產(chǎn)fasamycin E，敲除forY，產(chǎn)生一些新的Baeyer-Villiger氧化型的內(nèi)酯類(lèi)中間體，說(shuō)明ForX作為Baeyer-Villiger單氧化酶可使fasamycins的C環(huán)去芳構(gòu)化。通過(guò)體內(nèi)交叉喂養(yǎng)以及生物仿生半合成實(shí)驗(yàn)，作者發(fā)現(xiàn)這些內(nèi)酯類(lèi)產(chǎn)物在ForY的催化下以特殊的還原縮環(huán)反應(yīng)形成formicamycins。
微生物芳香聚酮類(lèi)化合物是生物合成相關(guān)分子中的大家族之一，結(jié)構(gòu)多樣且具有顯著的生物活性，如已應(yīng)用于臨床的四環(huán)素類(lèi)抗生素，蒽環(huán)類(lèi)抗腫瘤藥。其結(jié)構(gòu)多樣性主要通過(guò)后修飾酶引入，如?；榛?，糖基化，鹵化以及氧化還原，也可由氧化還原酶催化C-C鍵斷裂，重排使結(jié)構(gòu)更復(fù)雜化，如jadomycins，gilvocarcins以及chartreusins生物合成途徑中的黃素依賴的Baeyer-Villiger (BV) 單氧化酶。 Fig.1 Chemical skeletons of 1-21and 2D NMR structers determination of 18. Fig.2 Comparison of the fasamycin/formicamycin biosynthetic gene clusters. 由以上生信分析以及實(shí)驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)，作者分別通過(guò)cas9介導(dǎo)的基因編輯同框敲除forX，forY，敲除forX，只形成fasamycin E (3, fig.3c)，這一點(diǎn)證實(shí)ForX在formicamycin生物合成中發(fā)揮氧化功能，并且以鹵化的fasamycin為底物。敲除forY，產(chǎn)生6個(gè)新化合物17-22(fig.1，fig.3d)。通過(guò)與已知化合物3的ESI-MS，UV對(duì)比，以及2D NMR，確定17-21的結(jié)構(gòu)。這些結(jié)果說(shuō)明fasamycins轉(zhuǎn)化為formicamycins需要經(jīng)過(guò)由ForX催化fasamycin類(lèi)底物進(jìn)行Baeyer-Villiger反應(yīng)的擴(kuò)環(huán)和ForY催化Baeyer-Villiger中間體進(jìn)行兩電子還原以及C19位氫化物加成的縮環(huán)反應(yīng)。為了證實(shí)以上結(jié)論，作者試圖體外表達(dá)上述兩個(gè)蛋白，很不幸未能獲得可溶性蛋白，因此進(jìn)行仿生化學(xué)合成法研究生物合成途徑，向敲除forX的S. formicae 培養(yǎng)液中添加化合物18，9天后產(chǎn)生formicamycin同源物5，8，9，13，19，這一點(diǎn)與18是formicamycins的直接中間體以及ForY的潛在底物相一致。 Fig. 3 Mutational analysis of the tailoring enzyme encoding genes involved in formiacamycin biosynthesis. (a) S. formicae wild type; (b) S. formicae▲forV; (c)S. formicae ▲forX; (d)S. formicae ▲forY. 為了模仿ForY催化的生物合成轉(zhuǎn)化，作者使用硼氫化鈉還原化合物19（fig.4），得到4個(gè)化合物(23-26)，其中23和24是兩對(duì)具有formicamycin環(huán)結(jié)構(gòu)的（10RS, 19RS）非對(duì)映異構(gòu)體，UPLC分析(fig.5)得出二者的非對(duì)映過(guò)量值分別為41.3%和40.5%；25是C10-C19位雙鍵還原的內(nèi)酯，沒(méi)有發(fā)生通過(guò)縮環(huán)進(jìn)行的重排；NMR, MS顯示26為C11位脫氧化的19。 對(duì)于芳環(huán)系統(tǒng)脫芳構(gòu)化在天然產(chǎn)物中已有報(bào)道，如缺失agnestins和cryptosporioptides中可能編碼Baeyer-Villiger酶的基因，會(huì)有芳香前體的富集。對(duì)于ForX的Baeyer-Villiger活性，作者認(rèn)為可能存在兩種途徑（fig.6）。在第一種途徑中，過(guò)氧黃素作為親電試劑將氧引入到C10位形成叔羥基，然后對(duì)相鄰苯酚去質(zhì)子化。隨后隨著鍵遷移以及C20位質(zhì)子化發(fā)生重排。在第二種途徑中，ForX可能通過(guò)底物結(jié)合首先誘導(dǎo)環(huán)C自發(fā)互變異構(gòu)，隨后將過(guò)氧黃素中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移到C9羰基上產(chǎn)生氧鎓中間體，然后黃素過(guò)氧陰離子隨后在經(jīng)典BV-樣反應(yīng)中作為親核試劑產(chǎn)生內(nèi)酯中間體。作者認(rèn)為途徑I更適合，通過(guò)次氯酸介導(dǎo)依賴于黃素的鹵化酶將親核氯離子轉(zhuǎn)化為高反應(yīng)性的親電試劑，這一點(diǎn)是與ForX是Group A單氧化酶催化羥基化反應(yīng)相一致。 Fig.5 UPLC-UV analysis for the reduction products 23 and 24. 作者猜測(cè)ForY隨后作為黃素依賴的還原酶催化內(nèi)酯中間體兩電子還原，這個(gè)反應(yīng)可能是氫離子通過(guò)1,4-共軛進(jìn)攻C19位形成烯醇27。隨后烯醇式隨著C9-C10 sigma 鍵以及一個(gè)環(huán)氧化物中間體的形成而破壞，隨后的重排可產(chǎn)生具有總環(huán)收縮的C10叔羥基，這一反應(yīng)讓人聯(lián)想到 Favorskii反應(yīng)。此途徑與硼氫化鈉還原反應(yīng)形成的副產(chǎn)物以及C9-C10鍵形成過(guò)程中軌道重疊所需的立體空間相一致。Favorskii類(lèi)反應(yīng)在自然界中很罕見(jiàn)，在聚酮天然產(chǎn)物enterocin中曾有報(bào)道，該途徑涉及通過(guò)雙4-電子氧化激活前一中間體，該反應(yīng)由一個(gè)黃素依賴的單氧化酶EncM催化，該酶利用黃素-N5-氧化物而非過(guò)氧黃素中間體催化底物氧化并激化 Favorskii類(lèi)反應(yīng)，氧化促進(jìn)之后的縮醛和雜環(huán)化反應(yīng)，且由EncM介導(dǎo)。 在formicamycin生物合成途徑中，只產(chǎn)生單一立體構(gòu)型的產(chǎn)物而非如同過(guò)硼氫化鈉反應(yīng)所產(chǎn)生的產(chǎn)物，說(shuō)明ForY必定既控制立體化學(xué)也限制反應(yīng)協(xié)同物的產(chǎn)生。由ForY催化的還原環(huán)縮合在聚酮生物合成過(guò)程中非常特別，基因組分析沒(méi)有搜索到類(lèi)似BGC，說(shuō)明該途徑是formicamycin生物合成過(guò)程中特有的。
Fig. 6 The alternative pathways for each step of the proposed two-step ring expansion-contraction mechanism of formicamycin biosynthesis from fasamycin E.
來(lái)源：遇見(jiàn)
