介紹最近發(fā)表在Nature Review Chemistry上的一篇關(guān)于生物正交反應(yīng)的綜述，作者是來自University of California, Irvine的Jennifer A.Prescher教授。
生物正交化學(xué)使研究人員能夠研究生命系統(tǒng)中的生物分子。這些反應(yīng)具有很高的選擇性和生物相容性，可以在許多復(fù)雜的環(huán)境中進(jìn)行。但是，就像任何有機(jī)轉(zhuǎn)化一樣，沒有完美的生物正交反應(yīng)。為所需的應(yīng)用選擇“最合適”的反應(yīng)至關(guān)重要。因此，必須有多種化學(xué)試劑可供選擇，提供各種功能比如不同的反應(yīng)速率。在過去的幾年中，不僅在擴(kuò)大生物正交化學(xué)的數(shù)量上，而且在為特定應(yīng)用微調(diào)現(xiàn)有反應(yīng)性方面取得了長足的進(jìn)步。在這篇評論中，我們著重介紹生物正交反應(yīng)開發(fā)的最新進(jìn)展，重點(diǎn)是物理有機(jī)化學(xué)原理如何帶領(lǐng)探針設(shè)計(jì)。這些化學(xué)工具的不斷擴(kuò)展將提供精確調(diào)整過的試劑，并用于在不同的環(huán)境中操縱形成化學(xué)鍵。
如果要全面了解生命系統(tǒng)，就需要使用工具和方法來探測其自然條件中的生物分子，長期以來人們一直使用熒光蛋白和其他遺傳標(biāo)簽實(shí)現(xiàn)這種目的。盡管功能強(qiáng)大，但這些工具不適合直接監(jiān)視非蛋白質(zhì)目標(biāo)，包括小分子代謝物。對更具通用性的平臺(tái)的需求刺激了生物正交化學(xué)-高度選擇性反應(yīng)的發(fā)展，該反應(yīng)可用于共價(jià)標(biāo)記活細(xì)胞以及某些情況下的活生物體中的靶標(biāo)。數(shù)十年來，生物正交反應(yīng)已用于可視化和分析各種生物分子。這些研究為細(xì)胞和有機(jī)體生物學(xué)的各個(gè)方面提供了基本的知識(shí)。此類研究還揭示了生物正交工具包的局限性，啟發(fā)了更多對探針反應(yīng)性和選擇性的微調(diào)開發(fā)。
生物正交化學(xué)的所有應(yīng)用的核心是具有化學(xué)選擇性，并與生物系統(tǒng)相容的反應(yīng)性。此類反應(yīng)的發(fā)展可能很困難。溶劑和溫度是固定的，反應(yīng)必須在多種干擾官能團(tuán)之間進(jìn)行。通常不能僅僅通過加熱受體或添加更多試劑來加速反應(yīng)。因此，用于微調(diào)圓底燒瓶中化學(xué)反應(yīng)的方法通常無法用于生理環(huán)境，在該環(huán)境中幾乎無法更改任何參數(shù)。盡管如此，幾代化學(xué)家一直在努力控制活細(xì)胞和生物體中的鍵形成。他們的努力提供了可以在不損害生命系統(tǒng)的情況下執(zhí)行的反應(yīng)。
這篇綜述評估了生物正交反應(yīng)的發(fā)展，并著重于機(jī)械論如何推動(dòng)該領(lǐng)域的發(fā)展。像其他化學(xué)領(lǐng)域一樣，不存在“萬用”（指可以通用于所有情況）的反應(yīng)。相反，每個(gè)反應(yīng)都有其優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)，其局限性繼續(xù)推動(dòng)著新的進(jìn)步。在第一部分中，我們提供了生物正交化學(xué)的簡要?dú)v史，并介紹了早期探針開發(fā)的常見策略。然后，本綜述的大部分內(nèi)容展示了生物正交反應(yīng)設(shè)計(jì)的最新成就。我們還著重介紹了可同時(shí)用于多組分標(biāo)記的生物正交化學(xué)的工作。這些以及其他創(chuàng)新將繼續(xù)擴(kuò)大生物相容性和相互正交的試劑的范圍。
經(jīng)典的生物正交變換
化學(xué)家依靠強(qiáng)大而通用的反應(yīng)來制備復(fù)雜的分子。擬定合成路線時(shí)要考慮到試劑的可得性，產(chǎn)率和選擇性。理想情況下，反應(yīng)應(yīng)該速率快，選擇性好，同時(shí)適用于多種底物。實(shí)際上，大多數(shù)反應(yīng)不是普遍有效的，需要在不同情況下對溫度，pH或化學(xué)計(jì)量進(jìn)行調(diào)整。催化劑和溶劑的種類也多種多樣，以優(yōu)化收率。反應(yīng)范圍的限制通常成為新轉(zhuǎn)化的關(guān)鍵。發(fā)現(xiàn)反應(yīng)和改進(jìn)反應(yīng)的這種反復(fù)循環(huán)提供了在各種情況下控制鍵形成的綱要方法。在某些情況下，已經(jīng)開發(fā)了成百上千的專門試劑來解決反應(yīng)范圍的缺陷。
考慮到某些因素，迭代優(yōu)化也已用于調(diào)整用于生命系統(tǒng)的試劑（圖一）。正交生物官能團(tuán)必須在動(dòng)力學(xué)和代謝上穩(wěn)定，但在生理?xiàng)l件下必須與互補(bǔ)探針快速反應(yīng)。反應(yīng)還必須耐受水和其他生物官能團(tuán)。細(xì)胞和組織中的限制也排除了許多有機(jī)反應(yīng)。幾種生物學(xué)應(yīng)用也需要試劑的空間“足跡“盡可能的小。因此，開發(fā)小體積的化學(xué)試劑是另一個(gè)重要目標(biāo)。
圖1 | 將反應(yīng)從圓底燒瓶轉(zhuǎn)移到生物系統(tǒng)。細(xì)胞和組織中使用的反應(yīng)物（橙色球和?。┍仨毰c細(xì)胞功能兼容。具有挑戰(zhàn)性的應(yīng)用繼續(xù)推動(dòng)著生物正交反應(yīng)的發(fā)展。盡管在燒瓶中易于控制的變量在活體系統(tǒng)中通常是不變的，但在燒瓶或細(xì)胞中的優(yōu)化都遵循相似的原理。
那么，我們從哪里開始呢？尋找異源生物中不常見的官能團(tuán)是一個(gè)很好的起點(diǎn)。微生物，植物和其他物種通?？梢允褂貌溉閯?dòng)物細(xì)胞中不存在的化學(xué)和功能。這些基本單元可以在生物環(huán)境中生存，并且與哺乳動(dòng)物系統(tǒng)立即正交，從而使其成為生物正交化學(xué)的有吸引力的候選對象。一個(gè)典型的例子是炔烴，它存在于許多微生物代謝產(chǎn)物中，而在高級真核生物中卻不存在。炔已在許多環(huán)境中被用作生物正交基本單元。流行的生物正交官能團(tuán)還包括一些來自于合成化學(xué)的不太討喜的候選物。傳統(tǒng)上，有機(jī)疊氮化物和張力炔烴對于在生物系統(tǒng)中使用而言過于不穩(wěn)定，但是經(jīng)過細(xì)微的調(diào)整后，已經(jīng)成為本領(lǐng)域公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)試劑。這些示例為后續(xù)試劑開發(fā)提供了重要的經(jīng)驗(yàn)。在本節(jié)中，我們簡要介紹一些看似“不合適”的官能團(tuán)如何成為生物正交化學(xué)的兩種最常見類別的基礎(chǔ)：極性反應(yīng)和環(huán)加成（圖二）。我們重點(diǎn)介紹了這些探針開發(fā)的早期障礙和關(guān)鍵進(jìn)展，這些初步成功為試劑的持續(xù)改進(jìn)提供了路線圖。
圖2 | 調(diào)整反應(yīng)以用于生物應(yīng)用。 生物正交化學(xué)主要分為兩類：極性反應(yīng)（A部分）和環(huán)加成反應(yīng)（B部分）。顯示了限制（以紅色突出顯示）如何刺激新反應(yīng)（以綠色突出顯示）的發(fā)展的示例。
極性反應(yīng)
醛和酮是最早用作生物正交標(biāo)記的試劑。對生物分子標(biāo)記來說，這些羰基由于小尺寸和在生物系統(tǒng)中的相容性而具有吸引力。而且，這些親電試劑還容易與α-親核試劑如酰肼和氨氧基縮合（圖二Ab）。醛和酮的縮合反應(yīng)已用于標(biāo)記多種生物分子。然而，該反應(yīng)對pH敏感，并且在生理環(huán)境中相當(dāng)慢。苯胺催化劑可以提高反應(yīng)速率，但是在細(xì)胞環(huán)境中反應(yīng)仍然很難進(jìn)行。
盡管醛和酮在細(xì)胞中的使用較少，但只有少數(shù)其他生物正交官能團(tuán)可與它們的最小尺寸相媲美。其中最具影響力的是有機(jī)疊氮化物。該官能團(tuán)是非生物的，僅包含三個(gè)原子。疊氮化物在生物環(huán)境中非常惰性，但具有獨(dú)特的反應(yīng)活性。例如，它們可以與軟親核試劑反應(yīng)，包括三芳基膦（通過Staudinger還原反應(yīng)）。該反應(yīng)通過氮雜-葉立德中間體進(jìn)行，該中間體可被相鄰的親電試劑捕獲。Bertozzi及其同事利用此功能，在膦上安裝了一種酯，以捕獲氮雜葉立德（圖二Ad）。反應(yīng)最終通過酰胺鍵將兩種反應(yīng)物連接起來。這種變體（稱為施陶丁格連接法）適合在各種復(fù)雜環(huán)境（包括活細(xì)胞）中標(biāo)記疊氮化物。早期的亮點(diǎn)應(yīng)用是多糖和蛋白質(zhì)翻譯后修飾，此后還靶向了許多其他生物分子。施陶丁格連接法也是用于活體嚙齒動(dòng)物的第一個(gè)此類反應(yīng)，這是一種特別苛刻的環(huán)境。
施陶丁格連接的多功能性推動(dòng)了反應(yīng)發(fā)展的整個(gè)領(lǐng)域。許多早期研究的目的是提高鏈接反應(yīng)的速率。盡管施陶丁格的連接牢固到足以在體內(nèi)標(biāo)記多糖和其他生物分子，但緩慢的反應(yīng)速率卻對嚙齒動(dòng)物和高等生物的影像學(xué)研究具有挑戰(zhàn)性。需要大量試劑可以以在合理的時(shí)間尺度上驅(qū)動(dòng)共價(jià)鍵的形成，但由于許多膦探針的水溶性有限，因此這樣的濃度并不容易實(shí)現(xiàn)。這些缺點(diǎn)通常使施陶丁格連接在體內(nèi)的應(yīng)用受限，但其啟發(fā)了有機(jī)疊氮化物的其他類型的轉(zhuǎn)化。
環(huán)加成。
環(huán)加成因其出色的化學(xué)選擇性而成為流行的生物正交反應(yīng)（圖二Ba）。最早利用的方法之一是[3 + 2]與疊氮化物的環(huán)加成反應(yīng)。除了是溫和的親電子試劑外，有機(jī)疊氮化物是1，3-偶極子，可與炔烴反應(yīng)。由于炔烴在高級真核生物中很少見，因此它們是正交的。然而，疊氮化物-炔烴環(huán)加成通常需要高溫或高壓，以及與生物不相容的條件。一個(gè)關(guān)鍵的突破是發(fā)現(xiàn)可以使用一價(jià)銅加速環(huán)加成反應(yīng)（圖二Bb）。銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)（CuAAC）在化學(xué)生物學(xué)和其他學(xué)科中無處不在，并且仍在激發(fā)新的應(yīng)用。一價(jià)銅的細(xì)胞毒性阻止了其在體內(nèi)的應(yīng)用，因此人們開發(fā)出許多生物友好的催化劑。其中許多水溶性配體具有可穩(wěn)定一價(jià)銅并防止活性氧物種形成的功能。尤其是，聚三氮唑配體使CuAAC反應(yīng)能夠在活細(xì)胞和斑馬魚中進(jìn)行。
銅催化劑帶來的限制也啟發(fā)了化學(xué)家設(shè)計(jì)新的方法來連接1,3-偶極子。最有效的方法之一是依靠張力能使炔烴從其正常的線性幾何形狀彎曲。發(fā)現(xiàn)在不存在銅催化劑的情況下，環(huán)辛炔是可與疊氮化物反應(yīng)的最小的穩(wěn)定環(huán)炔烴。這項(xiàng)工作引出了張力促進(jìn)的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（SPAACs）的整個(gè)系列（圖二Bc）。此類反應(yīng)已廣泛用于復(fù)雜的生物環(huán)境中，包括植物，秀麗隱桿線蟲和小鼠。盡管SPAACs反應(yīng)可最大程度地降低在生物系統(tǒng)中的毒性，但某些炔烴會(huì)與生物硫醇反應(yīng)。而且，在反應(yīng)性最強(qiáng)的張力炔烴上觀察到最快的反應(yīng)速度約為1 M-1s-1，這不適用于某些體內(nèi)應(yīng)用。
為了兼顧反應(yīng)速度和生物相容性的需求，化學(xué)家已經(jīng)開發(fā)了其他環(huán)加成物。一類值得注意的是包括逆電子需求的Diels-Alder（IEDDA）環(huán)加成反應(yīng)（圖二Bd）。四嗪與反式環(huán)辛烯（TCO）之間的IEDDA反應(yīng)尤為突出（圖二Be）。這對之間的反應(yīng)速度比最活躍的SPAACs對快106倍。由于僅需要少量物質(zhì)來驅(qū)動(dòng)共價(jià)鍵形成，因此這種快速轉(zhuǎn)化已在細(xì)胞和生物中廣泛使用。四嗪-TCO環(huán)加成反應(yīng)的有利動(dòng)力學(xué)特征使得科學(xué)家能夠探索新的體內(nèi)影像學(xué)平臺(tái)，包括正電子發(fā)射斷層掃描和其他方式。四嗪-TCO反應(yīng)也已廣泛用于標(biāo)記生物分子，釋放前藥和激活酶，
調(diào)整生物正交反應(yīng)
盡管在過去的二十年中，科學(xué)家在生物正交反應(yīng)設(shè)計(jì)方面取得了令人矚目的成就，但局限性仍然存在。許多試劑在最苛刻的生物學(xué)環(huán)境中使用時(shí)不夠穩(wěn)定，或者在體內(nèi)應(yīng)用中反應(yīng)緩慢。而且，盡管許多反應(yīng)在單個(gè)目標(biāo)上都能很好地起作用，但是由于存在交叉反應(yīng)性問題，大多數(shù)不能組合使用來標(biāo)記多個(gè)目標(biāo)。因此，同時(shí)追蹤多種生物分子仍然是一個(gè)長期的挑戰(zhàn)?？偠灾?，這些局限性表明了不僅需要開發(fā)新的反應(yīng)，而且還需要對現(xiàn)有的化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行微調(diào)。下一節(jié)將重點(diǎn)介紹解決填補(bǔ)生物正交工具中的空白和擴(kuò)大反應(yīng)性多樣性的最新方法（圖二）。
調(diào)整極性試劑和反應(yīng)。
如上所述，一些最早的生物正交轉(zhuǎn)化涉及羰基和α-親核試劑的縮合反應(yīng)。這些反應(yīng)的可逆性給生物分子標(biāo)記帶來了挑戰(zhàn)。科學(xué)家已經(jīng)努力建立更穩(wěn)定的加合物，包括使用臨位穩(wěn)定基團(tuán)。一個(gè)重要的例子是硼酸（圖二Ac）。這些官能團(tuán)可以協(xié)助例如腙和肟形成加合物，并防止水解。硼酸還被用來穩(wěn)定由其他α-親核試劑形成的連接加合物，以及標(biāo)記肽和小蛋白上的N端半胱氨酸殘基。
與疊氮化物的極性反應(yīng)也已針對特定應(yīng)用進(jìn)行了調(diào)整。施陶丁格連接是早期的優(yōu)化目標(biāo)，其工作重點(diǎn)是提高反應(yīng)速率和試劑溶解度。在疊氮化物上引入吸電子基團(tuán)或在膦上引入給電子基團(tuán)可提高連接速度。例如，具有氟和氯取代基的缺電子芳基疊氮化物的速率比未取代的芳基疊氮化物的速率更快。有趣的是，在這些情況下形成的氮雜-內(nèi)酰胺是穩(wěn)定的加合物，無需利用膦形成親電子陷阱。此后，鹵代芳基疊氮化物已被用于標(biāo)記活細(xì)胞中的多糖和蛋白質(zhì)，合成適合于施陶丁格連接的富電子膦并不那么簡單，更多的親核骨架可以減少蛋白質(zhì)中的二硫鍵并易于快速氧化。出于這種目的，許多膦探針已針對細(xì)胞和其他應(yīng)用進(jìn)行了調(diào)整。
為了提高生物相容性，還對膦試劑進(jìn)行了調(diào)整。例如，Ren等人合成的包含氟磺酸酯的膦（圖二Ae）。這種處理方式類似于原始的施陶丁格連接中利用酯捕獲氮雜-葉立德。在水解并排出氟化物后，該連接產(chǎn)生了氨基磺酸酯。與最初的施陶丁格連接探針相比，改性的膦在水溶性上得到顯著改善，氨基磺酸酯產(chǎn)品還可以模擬許多生物分子和代謝物中存在的磷酸骨架。
科學(xué)家還調(diào)整了完全不同的磷親核試劑的疊氮化物連接。例如，磷酸酯和亞膦酸酯與芳基疊氮化物反應(yīng)以分別提供氨基磷酸酯和氨基亞膦酸酯加合物。這些反應(yīng)可用于通過多種探針選擇性修飾蛋白質(zhì)和其他生物分子。
調(diào)整的膦也已在其他化學(xué)領(lǐng)域得到開發(fā)。例如，膦可以與邁克爾受體反應(yīng)并形成穩(wěn)定的磷加合物。這種反應(yīng)已被用于標(biāo)記生物分子。例如，三（2-羧乙基）膦（一種廣泛用于生物學(xué)的水溶性還原劑）與缺電子的烯烴反應(yīng)。該反應(yīng)用于研究活細(xì)胞中的蛋白質(zhì)糖基化和組蛋白上的巴豆?；?。
環(huán)磷烯酮衍生物（CpX，其中X為O，S或Et2N+）是膦連接試劑中的最新成員。當(dāng)X 為氧時(shí)，連接先經(jīng)過基礎(chǔ)的邁克爾加成反應(yīng)，然后開環(huán)形成活性乙烯酮-內(nèi)酯（圖三）。該乙烯酮可被膦上的鄰位親核試劑捕獲，從而提供α，β-不飽和羰基。由于單取代的CpOs易于與生物學(xué)上相關(guān)的硫醇反應(yīng)，所以已發(fā)展了許多具有雙取代官能團(tuán)的生物惰性骨架。這些最新的試劑可用于活細(xì)胞。
圖3丨環(huán)丙烯酮衍生物的反應(yīng)性 環(huán)丙烯酮（CpX）衍生物表現(xiàn)出獨(dú)特的反應(yīng)活性，具有氧或硫原子（分別為CpO和CpS）的類似物通過乙烯酮-葉立德中間體與膦反應(yīng)。相比之下，含氮骨架（CpN+）反應(yīng)形成含膦雙環(huán)。
CpOs的反應(yīng)性可以通過雜原子置換來進(jìn)一步調(diào)節(jié)，這是在生物正交化學(xué)中調(diào)整探針的常用策略。CpO的硫變體，環(huán)丙烯硫酮（CpS）也可以通過硫代乙烯-葉立德中間體與膦快速反應(yīng)， 硫羰基類物質(zhì)是研究蛋白穩(wěn)定性和功能的生物物理學(xué)探針。還已經(jīng)探索了CpO的氮雜類似物，有趣的是，環(huán)丙銨（CpN+）離子作為生物正交試劑，CpN +離子通過與CpO或CpS衍生物不同的機(jī)理與膦反應(yīng)。先通過邁克爾加成反應(yīng)生成烯胺，該烯胺經(jīng)過質(zhì)子轉(zhuǎn)移而不是開環(huán)生成含磷雙環(huán)（圖三）。因此，核心骨架的微小變化會(huì)對反應(yīng)性產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響。
調(diào)整偶極子用于生物正交環(huán)加成
疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)仍然是用于檢驗(yàn)生物系統(tǒng)的最流行的1,3-偶極環(huán)加成反應(yīng)之一。這個(gè)成功的連接為探索新的1,3-偶極子提供了靈感。這類化合物包括“硝酮”（圖四a），它比疊氮化物與某些炔烴反應(yīng)更快。類似于疊氮炔烴加成，硝酮炔烴環(huán)加成反應(yīng)也可以經(jīng)由銅催化。這些反應(yīng)已用于成像糖代謝和受體-哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的配體相互作用以及細(xì)菌中的肽聚糖結(jié)構(gòu)。
生物正交偶極子集的另一個(gè)新面孔是悉尼酮（sydnone）。該1，3-偶極炔烴反應(yīng)生成吡唑加合物。盡管最初的應(yīng)用需要銅催化，但隨后的工作發(fā)現(xiàn)化合物也能夠與張力炔烴進(jìn)行無銅反應(yīng)。悉尼酮可以通過修飾以調(diào)節(jié)其在生物學(xué)應(yīng)用中的反應(yīng)性。例如，氯取代的悉尼酮與常見的張力炔烴，雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）的反應(yīng)速率提高了30倍。氟取代進(jìn)一步提高了悉尼酮與各種張力炔烴的反應(yīng)速率
重氮化合物，一種有機(jī)疊氮化物的近親也已被類似地調(diào)整為偶極子，并用于生物正交應(yīng)用。重氮基團(tuán)的小尺寸在生物分子標(biāo)記具有吸引力，但長期以來人們一直認(rèn)為此類官能團(tuán)對于細(xì)胞而言反應(yīng)性太強(qiáng)。但是，重氮官能團(tuán)與芳基類或吸電子基團(tuán)（例如酯或酰胺）結(jié)合時(shí)是穩(wěn)定的。重氮化合物與張力炔烴的反應(yīng)速率數(shù)倍于相應(yīng)的疊氮化類似物反應(yīng)。重氮-環(huán)辛炔反應(yīng)已用于標(biāo)記細(xì)胞的多糖以及其他靶標(biāo)。重要的是，所得吡唑加合物對幾種生物親核試劑穩(wěn)定。此外，這類重氮物已提供了與非環(huán)缺電子烯烴反應(yīng)的骨架，可以在疊氮化物存在下進(jìn)行的反應(yīng)。
更具反應(yīng)性的1,3-偶極子也已被用于生物正交應(yīng)用。反應(yīng)物被隱藏，直到施加了外部觸發(fā)（通常是光），才能使反應(yīng)物按需釋放。腈亞胺（Nitrile imines）就是這類偶極子， 它與張力烯烴（如降冰片烯和環(huán)丙烯）發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)，但在沒有連接目標(biāo)的情況下會(huì)快速水解?？梢詫㈦鎭啺锋i住以獲得在生物環(huán)境中更穩(wěn)定的官能團(tuán)，例如四唑或悉尼酮，然后使用紫外線照射來釋放活性物種?？梢葬槍Σ煌ㄩL的光調(diào)控起始四唑發(fā)色團(tuán)的光解作用（即腈亞胺釋放）。這種新增的控制方法激發(fā)了對其他“光點(diǎn)擊”反應(yīng)的探索，以擴(kuò)大生物正交化學(xué)的研究范圍。腈亞胺還通過電子和位阻修飾得到了廣泛的修飾。
為生物正交環(huán)加成而調(diào)控親偶極子試劑
以張力環(huán)炔烴這種親偶極子試劑為例，說明對生物正交環(huán)加成的調(diào)控。為了提高反應(yīng)速率或提高環(huán)的穩(wěn)定性，已經(jīng)進(jìn)行了大量的努力來修飾張力環(huán)。例子包括調(diào)節(jié)環(huán)的大小或構(gòu)象，電子擾動(dòng)，內(nèi)環(huán)雜原子的安裝及其組合（圖四b）。還為增加這些脂肪族探針的水溶性做出了巨大努力。已經(jīng)研究了雜環(huán)衍生物（最多12元環(huán)）雜原子變體通常更水溶性和穩(wěn)定。但是，擴(kuò)環(huán)的好處是以犧牲速率為代價(jià)的：這是生物正交試劑調(diào)整中普遍存在的折衷方案?？紤]到兼顧反應(yīng)性和穩(wěn)定性，BCN是一種更具影響力的環(huán)炔烴。與環(huán)辛炔相比，該骨架具有更大的張力（由于稠合的環(huán)丙烷環(huán)），但在細(xì)胞環(huán)境中非常穩(wěn)定。加上其合成的可得性，BCN已成為幾個(gè)領(lǐng)域中用于環(huán)加成反應(yīng)的主要張力炔烴。在最近的例子中，BCN-熒光團(tuán)綴合物用于活細(xì)胞的超分辨率成像（圖四c、d）。 FtsZ是一種參與細(xì)菌細(xì)胞分裂的蛋白質(zhì)，通過酶化學(xué)處理裝上疊氮化物。隨后用細(xì)胞可滲透的BCN衍生物（帶有光開關(guān)的若丹明）進(jìn)行處理，可以觀察到蛋白質(zhì)的定位模式。
圖4丨用于偶極環(huán)加成反應(yīng)的一系列試劑。a丨各種1,3-偶極子可用于生物正交標(biāo)記。有機(jī)疊氮化物是最早被用于細(xì)胞中環(huán)加成反應(yīng)的物質(zhì)。最近，已經(jīng)開發(fā)出重氮，亞砜和硝酮官能團(tuán)用于生物分子標(biāo)記。高反應(yīng)性偶極（包括一氧化二氮，亞胺和乙叉化物）也是可行的連接子，通常通過光解或化學(xué)解籠作用“按需”生產(chǎn)。b丨可用于生物正交環(huán)加成的幾種類型張力炔。這些試劑來來源于環(huán)辛炔的變體。對環(huán)辛炔的廣泛修飾提供了具有可控反應(yīng)性的試劑組合。c丨在生物正交環(huán)加成中的示例應(yīng)用。FtsZ。一種參與細(xì)胞分裂的細(xì)菌蛋白配有疊氮化物提手。隨后與雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）-可光轉(zhuǎn)換的熒光團(tuán)結(jié)合物的連接使得在活大腸桿菌中能夠進(jìn)行超高分辨率顯微鏡檢查。d | FtsZ在活大腸桿菌中定位的衍射極限熒光（左）和超分辨率（右）顯微鏡圖像。插圖顯示細(xì)菌細(xì)胞的明場圖像。
通過使用計(jì)算化學(xué)方法，科學(xué)家更易于調(diào)控環(huán)炔的反應(yīng)性。計(jì)算化學(xué)可以同時(shí)預(yù)測空間結(jié)構(gòu)和電子特征，調(diào)控骨架以獲得所需的結(jié)果。一種完整的調(diào)節(jié)環(huán)加成反應(yīng)對的方法依賴于畸變/相互作用模型。該分析通過計(jì)算形變能（即反應(yīng)物通過理想的過渡態(tài)幾何結(jié)構(gòu)所需的能量）和相互作用能（與兩個(gè)反應(yīng)物分子之間的軌道重疊有關(guān)）之間的差來計(jì)算給定反應(yīng)的激活勢壘。然后將計(jì)算出的活化能與預(yù)測的速率常數(shù)相關(guān)聯(lián)，該常數(shù)最終可以指導(dǎo)調(diào)控試劑?；?相互作用模型在生物正交試劑設(shè)計(jì)中的最早應(yīng)用之一涉及一系列的雙芳基環(huán)辛炔酮類似物。這項(xiàng)研究揭示了阻礙雙芳基環(huán)辛炔酮與疊氮化物反應(yīng)的結(jié)構(gòu)特征，并為開發(fā)改進(jìn)的環(huán)辛炔奠定了基礎(chǔ)。除其他生物正交環(huán)加成反應(yīng)外，類似的計(jì)算研究已用于微調(diào)悉尼酮-環(huán)炔反應(yīng)。
調(diào)整親二烯體的生物正交環(huán)加成反應(yīng)
近年來，IEDDA反應(yīng)領(lǐng)域的并行發(fā)展進(jìn)一步擴(kuò)大了生物正交化學(xué)的數(shù)量。特別是具有TCO的反應(yīng)已在細(xì)胞和體內(nèi)中廣泛使用。這樣的轉(zhuǎn)化也已經(jīng)成為廣泛的試劑調(diào)控的目標(biāo)。大量的努力集中在加速四嗪TCO連接的動(dòng)力學(xué)上（圖五）。假設(shè)增加TCO張力可提高反應(yīng)速率，類似于偶極環(huán)加成中炔烴的應(yīng)力作用。為此，F(xiàn)ox及其同事設(shè)計(jì)了一種骨架，其中TCO被迫采用半椅構(gòu)型（包括帶有二氧戊環(huán)的TCO（d-TCO）和張力的TCO，稱為s-TCO）。預(yù)計(jì)這些官能團(tuán)的能量比TCO的冠狀構(gòu)象高5.6-5.9kcal mol-1。反應(yīng)性更強(qiáng)的d-TCO和s-TCO變體顯示的雙分子速率常數(shù)高達(dá)3x 106M-1s-1。
與張力炔烴相似，對張力烯烴也采用了環(huán)收縮策略。例如，反式環(huán)庚烯（TCH）類似物是IEDDA與四嗪類環(huán)加成反應(yīng)中的強(qiáng)親二烯體。TCH在環(huán)境條件下易于異構(gòu)化，但可以與一價(jià)銀形成穩(wěn)定的復(fù)合物并被分離出來。另外，結(jié)合內(nèi)環(huán)硅原子可以制備產(chǎn)生更穩(wěn)定的七元環(huán)烯烴sila-TCH（SiTCH）。SiTCH中較長的Si-C鍵長度可減輕某些環(huán)張力，從而較容易實(shí)現(xiàn)分離。計(jì)算化學(xué)研究表明，SiTCH與二苯基四嗪的反應(yīng)活化障礙明顯低于s-TCO，從而可以快速連接。SiTCH和模型四嗪的二級速率常數(shù)為1.14x 107M-1s-1，是有記錄以來最快的生物正交連接。然而，盡管它們的速率很高，但是在存在細(xì)胞硫醇的情況下，TCH和SiTCH會(huì)迅速降解。
圖5丨用于IEDDA反應(yīng)的張力烯烴的示例。親二烯體已被廣泛地調(diào)控以調(diào)節(jié)反電子需求的Diels-Alder（IEDDA）與四嗪的環(huán)加成反應(yīng)的速率。反式環(huán)辛烯（TCO）是典型的親雙烯體。對TCO進(jìn)行了修釋以獲取反應(yīng)速度更快，更具生物相容性的試劑。一些骨架具有內(nèi)環(huán)雜原子（DOTCO，OSi-TCH和oxoTCO），構(gòu)象約束（二氧雜TCO（d-TCO）和張力TCO（s-TCO））和收縮環(huán)（反式環(huán)庚烯（TCH）和sila-TCH （SiTCH））。通常，在存在生物硫醇的情況下，最快的反應(yīng)骨架表現(xiàn)出最短的半衰期（t1/2）。PBS為磷酸鹽緩沖溶液。
1,3-二取代的環(huán)丙烯，作為IEDDA反應(yīng)的替代性親二烯體，也已針對各種應(yīng)用進(jìn)行了調(diào)控。Nguyen和其他人報(bào)道這些骨架可在生物環(huán)境中與四嗪反應(yīng)。與TCO相比，四嗪和環(huán)丙烯之間的反應(yīng)要慢得多，但是，環(huán)丙烯的小尺寸和細(xì)胞穩(wěn)定性使其在復(fù)雜環(huán)境中對生物分子的研究具有吸引力。Chin及其同事的一個(gè)著名例子使用了環(huán)丙烯賴氨酸類似物來監(jiān)測果蠅中新生的蛋白質(zhì)生物合成。
改變環(huán)丙烯的空間結(jié)構(gòu)會(huì)顯著反應(yīng)性。使用畸變/相互作用模型可以預(yù)測，環(huán)丙烯C3位的空間體積增加會(huì)大大降低其與四嗪的反應(yīng)性。反應(yīng)性降低歸因于過渡態(tài)的幾何約束。預(yù)測環(huán)加成反應(yīng)物種之間的軌道重疊阻礙會(huì)減慢連接速度。的確，即使3,3-二取代的環(huán)丙烯經(jīng)受各種官能化的四嗪，也沒有實(shí)驗(yàn)觀察到反應(yīng)，但是3,3-取代的環(huán)丙烯仍然與腈亞胺反應(yīng)，這種差異反應(yīng)性被用來串聯(lián)標(biāo)記兩種蛋白質(zhì)。
通過在C3引入螺環(huán)可以進(jìn)一步調(diào)控環(huán)丙烯。根據(jù)晶體學(xué)數(shù)據(jù)，與母體環(huán)丙烯1相比，環(huán)丙烯2在兩個(gè)C3基團(tuán)之間的鍵角減?。▓D六a）。減小的鍵角使取代基遠(yuǎn)離引入的腈亞胺，并使反應(yīng)速率增加15倍（圖六b）。螺環(huán)環(huán)丙烯還顯示出與某些四嗪的反應(yīng)性，并已被用于標(biāo)記活細(xì)胞中的細(xì)胞表面受體。螺環(huán)內(nèi)的雜原子通過降低LUMO能量進(jìn)一步提高了環(huán)丙烯的反應(yīng)性。最新的研究中為螺環(huán)環(huán)丙烯裝配了光敏籠。打開開關(guān)后骨架可用于IEDDA連接。這些被鎖住的試劑同時(shí)對生物分子進(jìn)行時(shí)間-空間上的標(biāo)記，但其合成仍然具有挑戰(zhàn)性。
還已經(jīng)研究了四嗪作為其他生物相容性環(huán)加成反應(yīng)的反應(yīng)物，例如涉及異腈的轉(zhuǎn)化。這些親二烯體通過[4 + 1]環(huán)加成與四嗪反應(yīng)生成亞胺產(chǎn)物。對于伯、仲異腈，所得的亞胺容易進(jìn)行互變異構(gòu)化和水解，從而釋放出胺。事實(shí)證明，此類異腈可用作氨基熒光團(tuán)和小分子藥物的籠子。適當(dāng)調(diào)控的異腈可以減輕水解，例如，叔異腈與四嗪反應(yīng)形成穩(wěn)定的連接加合物，因?yàn)樗鼈儫o法進(jìn)一步反應(yīng)。由于其體積小，用途廣泛，因此已被用于標(biāo)記生物分子，包括蛋白質(zhì)和多糖。
簡單的乙烯基也與四嗪探針進(jìn)行IEDDA反應(yīng)。乙烯基基序的小尺寸對于生物分子標(biāo)記策略具有吸引力。然而，即使使用富含電子的乙烯基試劑，迄今為止所檢查的大多數(shù)烯烴都具有較低的水溶性和較慢的反應(yīng)速率。相比之下，乙烯基硼酸（VBA）與四嗪的反應(yīng)明顯更快。反應(yīng)釋放出硼酸，這是該反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力。配備富電子的VBA和配有羥基的四嗪（與硼酸基序配位）可實(shí)現(xiàn)更快的環(huán)加成反應(yīng)，VBA-四嗪連接已被用于剖析蛋白酶體抑制劑在活細(xì)胞中的功效。已對許多其他環(huán)狀烯烴和丙烯酸烯烴進(jìn)行了與四嗪反應(yīng)的研究。
圖6 | 立體修飾可調(diào)節(jié)環(huán)丙烯的反應(yīng)性。a丨與母體化合物1相比，螺環(huán)環(huán)丙烯2中C3取代基之間的夾角減小。b丨減小的鍵角將過渡態(tài)的空間碰撞減至最小，從而加快了與腈亞胺的反應(yīng)。krel為相對速率常數(shù)。
調(diào)控二烯體的生物正交環(huán)加成反應(yīng)
IEDDA反應(yīng)的另半部分，即二烯（通常為四嗪）也已被修飾以改變穩(wěn)定性和反應(yīng)性（圖二Bf）。在一實(shí)施例中，通過電子攝動(dòng)來調(diào)節(jié)四嗪探針的穩(wěn)定性。最初發(fā)現(xiàn)含有四嗪官能團(tuán)的氨基酸在細(xì)胞環(huán)境中水解， 不穩(wěn)定的仲胺鍵促進(jìn)了水解，給電子胺基團(tuán)也減慢了IEDDA反應(yīng)速度。去除”胺把手”解決了這兩個(gè)限制。在另一個(gè)實(shí)例中，合成了平面四嗪以促進(jìn)胺的快速釋放與TCO反應(yīng)。用帶有TCO籠的氨基酸的模型酶篩選四嗪，最好的四嗪類化合物在少至50 μM的濃度下，可在4分鐘內(nèi)完成幾乎定量的反應(yīng)。
在生物正交化學(xué)中，某些四嗪反應(yīng)所達(dá)到的速率是無與倫比的。然而，如此高的速率通常以探針穩(wěn)定性為代價(jià)。許多最具反應(yīng)性的四嗪與硫醇反應(yīng)，可導(dǎo)致脫靶效應(yīng)和細(xì)胞中高背景標(biāo)記物。為了解決這一問題，一些研究小組從籠狀生物正交試劑中汲取了靈感，這些工作集中于利用官能團(tuán)的氧化還原特性原位釋放活性四嗪。還原性二氫四嗪對親二烯體無反應(yīng)，在生物環(huán)境中穩(wěn)定。然后可以使用酶法或光催化法將二氫四嗪原位氧化為四嗪。這樣的策略甚至可以將最具反應(yīng)性的四嗪應(yīng)用于生物環(huán)境中。鎖在籠中的四嗪也已被用于用生物分子修飾電極表面。
一些四嗪官能團(tuán)的不穩(wěn)定性激發(fā)了對缺電子性較弱的二烯的探索，包括1,2,4-三嗪。像它們的四嗪類似物一樣，三嗪通過IEDDA與張力的π系統(tǒng)（例如TCO和BCN）反應(yīng)。盡管這些反應(yīng)的速度明顯慢于四嗪，但三嗪可以在存在生物硫醇的條件下在升高的pH值下穩(wěn)定超過24小時(shí)。此后，這些骨架被安裝在蛋白質(zhì)中，并在體外酶促地附著在DNA上。1,2,4-三嗪還經(jīng)過電子調(diào)諧，以實(shí)現(xiàn)更快的動(dòng)力學(xué)活性。例如，吸電子吡啶鎓基團(tuán)已被用于增加環(huán)加成速率。這些骨架已被用于標(biāo)記活細(xì)胞中的線粒體。對三嗪核的微小空間修飾也改變了與張力炔烴的反應(yīng)方式。在最近的研究中，畸變/相互作用模型預(yù)測C3和C6處的三嗪取代將減少與空間位阻大的張力炔烴的反應(yīng)性。為了使成鍵中心（也就是C3和C6）的空間碰撞減至最小，預(yù)測此類反應(yīng)仍可使用C5取代的異構(gòu)體進(jìn)行。通過同時(shí)、雙重標(biāo)記兩個(gè)蛋白質(zhì)靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)證實(shí)了這些預(yù)測。
可以參與IEDDA環(huán)加成反應(yīng)的二烯的數(shù)量也在增加。最近顯示，含氮雜環(huán)4H-吡唑可與張力的BCN反應(yīng)。首先，吡唑需要調(diào)控以提高反應(yīng)速率， 通過添加氟取代基通過逆向的超共軛作用增加了骨架的抗芳香族特性。吡唑環(huán)的這種失穩(wěn)將因此導(dǎo)致更快的連接。計(jì)算分析證實(shí)，偕二氟基團(tuán)會(huì)降低4H-吡唑的LUMO能量，從而導(dǎo)致與BCN的快速反應(yīng)性。沿著反應(yīng)坐標(biāo)的這種抗芳香性考慮可以在生物正交反應(yīng)設(shè)計(jì)中更普遍地利用。
另一類二烯包括鄰醌，張力促進(jìn)的氧化控制的環(huán)辛炔與1,2-鄰醌環(huán)加成反應(yīng)是一個(gè)例子。在早期迭代中，使用外源氧化劑將1,2-鄰苯二酚轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的醌。這些張力促進(jìn)的氧化控制的環(huán)辛炔-1,2鄰醌反應(yīng)比疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應(yīng)（二階速率常數(shù)約為500 M-1s-1）快幾個(gè)數(shù)量級，并且與某些四嗪-TCO連接反應(yīng)相當(dāng)。后來的研究表明，可使用酪氨酸酶將可遺傳編碼的酪氨酸標(biāo)簽原位選擇性氧化為醌。然后可以將這些官能團(tuán)用于附加小分子以形成抗體-藥物偶聯(lián)體（ADC）。該策略使得能夠控制附著于抗體的“彈頭”的位置和數(shù)量。鄰-喹諾酮也能與諸如環(huán)丙烯之類的張力烯烴有效地反應(yīng)。但是，原位生成鄰醌的要求可能會(huì)帶來一些限制。已經(jīng)研究了鄰-喹啉酮醌甲基化物作為更通用的替代物，因?yàn)檫@些骨架可以在生物環(huán)境中原位產(chǎn)生而無需外部觸發(fā)。這些官能團(tuán)通過雜Diels-Alder環(huán)加成反應(yīng)與乙烯基硫醚強(qiáng)烈反應(yīng)，形成不尋常的硫縮醛加合物，并在各種pH值下在水溶液中均穩(wěn)定。
結(jié)合相互正交的反應(yīng)
從上面可以明顯看出，過去十年來，可用于生物應(yīng)用的化學(xué)反應(yīng)數(shù)量激增。盡管工具包已擴(kuò)展，但一次應(yīng)用多個(gè)反應(yīng)仍然具有挑戰(zhàn)性。新反應(yīng)的開發(fā)主要集中在標(biāo)記單個(gè)目標(biāo)上。鑒定生物正交化學(xué)的相容組合將使多組分標(biāo)記研究成為可能，從而拓寬了可以檢查的生物過程的范圍。從歷史上看，找到這樣的反應(yīng)組合一直是一項(xiàng)挑戰(zhàn)，因?yàn)樵S多常見的試劑會(huì)相互交叉反應(yīng)。近年來，借助計(jì)算化學(xué)和反應(yīng)調(diào)節(jié)，人們對正交反應(yīng)的搜索已大大加快。
具有獨(dú)特機(jī)理的生物正交反應(yīng)非常適合于多組分標(biāo)記研究。具有不同反應(yīng)模式的試劑通?？梢跃徑饨徊娣磻?yīng)問題。例如，疊氮化物-炔烴環(huán)加成可與肼-酮縮合、各種IEDDA試劑、一些1.3偶極子和其他官能團(tuán)串聯(lián)使用。還研究了使用三個(gè)相互兼容的生物正交基團(tuán)的策略，以三標(biāo)記法為例，該方法以含疊氮化物，含環(huán)丙烯和炔烴的糖為特征，研究植物細(xì)胞中糖代謝的異質(zhì)性。但是，由于反應(yīng)物種之間的交叉反應(yīng)性，無法同時(shí)進(jìn)行連接。連接之間還需要進(jìn)行笨拙的洗滌，從而破壞了時(shí)間尺度上的分辨率。迄今為止，只有三項(xiàng)研究同時(shí)進(jìn)行了三重標(biāo)記。一個(gè)例子是使用兩種四嗪：一種在空間上受阻并與少量異腈選擇性反應(yīng)，另一種在典型的IEDDA環(huán)加成反應(yīng)中將TCO連接起來。將四嗪反應(yīng)與疊氮化物-張力的炔烴對合并以進(jìn)行三重標(biāo)記?；旌先N模型蛋白，分別用大體積的四嗪，空間位阻較小的四嗪或疊氮化物標(biāo)記，并與與異腈，TCO或張力炔偶聯(lián)的光譜分辨熒光團(tuán)反應(yīng)。通過凝膠內(nèi)熒光檢測匹配的加合物，沒有交叉反應(yīng)的跡象（圖七）。盡管這項(xiàng)研究僅在模型環(huán)境中展示了三組分標(biāo)簽，但該試劑應(yīng)也適用于其他生物學(xué)環(huán)境。
圖7丨結(jié)合生物正交化學(xué)進(jìn)行多組分標(biāo)記。a |有三個(gè)不同的反應(yīng)：[4 + 1]四嗪（Tz1）-異腈環(huán)加成，[4 + 2]四嗪（Tz2）-反式環(huán)辛烯（TCO）環(huán)加成和[3 +2]疊氮化物-二苯并環(huán)辛炔（DBCO）環(huán)加成 用于同時(shí)標(biāo)記三種模型蛋白（牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA）和溶菌酶（LYSO））。b |通過凝膠電泳，然后進(jìn)行熒光掃描，觀察共價(jià)蛋白加合物。沒有檢測到交叉反應(yīng)。
探索新的反應(yīng)類型
以識(shí)別為目的其他類型的生物正交化學(xué)將繼續(xù)支撐多組分標(biāo)記研究。最近探索化學(xué)空間新領(lǐng)域的努力和對現(xiàn)有連接的其他調(diào)整是富有成果的， 硼試劑在這方面已受到關(guān)注。在一實(shí)例中，二硼探針與N-氧化物選擇性反應(yīng)。重要的是，連接是在最嚴(yán)苛的生物環(huán)境之一的細(xì)胞內(nèi)有效進(jìn)行的。該反應(yīng)的獨(dú)特機(jī)理也與幾種現(xiàn)有的生物正交化學(xué)相容。
極性試劑設(shè)計(jì)中最值得注意的發(fā)展也許涉及到六價(jià)硫氟化物。這些官能團(tuán)在細(xì)胞環(huán)境中非常穩(wěn)定，并通過六價(jià)硫氟化物交換（SuFEx）化學(xué)與氧或氮親核試劑發(fā)生強(qiáng)烈反應(yīng)。SuFEx試劑已用于基于藥物設(shè)計(jì)、活性蛋白和其他蛋白質(zhì)靶向研究。它們也已用于通過鄰近驅(qū)動(dòng)的交聯(lián)來檢查蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用。SuFEx親電試劑還提供了一種溫和方便的方法，可將生物正交疊氮化物引入各種胺靶標(biāo)，進(jìn)一步例證了這些官能團(tuán)的用途。
對新的環(huán)加成平臺(tái)的探索也正在擴(kuò)展生物正交工具包。一個(gè)例子涉及四環(huán)庚烷額連接。 該反應(yīng)是與鎳-雙（二硫代戊二烯）配合物的 [2σ+2σ+2π]環(huán)加成反應(yīng)，這是一種獨(dú)特的反應(yīng)方式。四環(huán)庚烷是高度張力的分子（張力能約為80 kcal mol-1），但可以在水溶液條件和存在硫醇的環(huán)境中穩(wěn)定較長時(shí)間。四環(huán)庚烷甚至已通過遺傳密碼擴(kuò)展用于細(xì)胞內(nèi)標(biāo)記應(yīng)用。四環(huán)庚烷反應(yīng)的新穎性可能會(huì)激發(fā)繼續(xù)探索其他用于生物正交應(yīng)用的環(huán)加成組合。
生物正交反應(yīng)也已經(jīng)擴(kuò)展到包括過渡金屬。這些金屬實(shí)際上在細(xì)胞環(huán)境中不存在，并且可以形成穩(wěn)定的C-C鍵，從而使其對選擇性標(biāo)記應(yīng)用具有可行性。關(guān)于此主題的重點(diǎn)評論可以在其他地方找到，但我們在下面重點(diǎn)介紹一些著名的例子。水溶性一價(jià)金絡(luò)合物已被開發(fā)來驅(qū)動(dòng)在水性介質(zhì)中形成共價(jià)鍵。金納米顆粒也已用于斑馬魚的成像。盡管金屬絡(luò)合物必須與骨架蛋白結(jié)合，但是可以利用更多反應(yīng)性的二價(jià)金物種進(jìn)行選擇性酰胺化反應(yīng)。受銅催化的啟發(fā)，幾個(gè)研究小組對配體進(jìn)行了優(yōu)化，以形成水溶性，毒性最小的鈀配合物。一些已被用于細(xì)胞中的Suzuki-Miyaura偶聯(lián)，以及Sonogashira反應(yīng)和炔基-氨基甲酸酯脫保護(hù)。鈀納米顆粒和其組件也已經(jīng)被開發(fā)用于在纖維素中進(jìn)行各種轉(zhuǎn)化。釕化學(xué)和銥光催化學(xué)方面的類似進(jìn)展使生物分子靶向成為可能。
蛋白質(zhì)生物共軛技術(shù)的新發(fā)展也被用于更普遍的生物正交應(yīng)用。例如，芳基重氮離子是與富電子芳族側(cè)鏈（例如酪氨酸）強(qiáng)烈反應(yīng)的親電子試劑。由于蛋白質(zhì)中酪氨酸殘基的豐度，使用芳基重氮進(jìn)行特定位點(diǎn)修飾在歷史上具有挑戰(zhàn)性。進(jìn)一步的研究揭示了5-羥基色氨酸與芳基重氮試劑之間的選擇性反應(yīng)。5-羥色氨酸中額外的電子密度使得能夠使用反應(yīng)性較低的重氮試劑，從而防止了其他芳香族側(cè)鏈（例如酪氨酸）的背景標(biāo)記。此反應(yīng)此后已用于標(biāo)記重組蛋白和抗體衍生物，并且預(yù)期會(huì)有其他靶標(biāo)。其他蛋白質(zhì)標(biāo)記策略的進(jìn)一步調(diào)控可能會(huì)提供更多的生物正交試劑。
總結(jié)
生物正交化學(xué)的核心是在嚴(yán)苛環(huán)境下控制反應(yīng)性官能團(tuán)。如何設(shè)計(jì)一對試劑以在細(xì)胞或整個(gè)生物體內(nèi)形成單一加合物？對這些反應(yīng)的嚴(yán)格要求經(jīng)常迫使研究人員探索非常規(guī)的方法。歷史性的工作提供了一套初始試劑，其中許多試劑仍用于體內(nèi)生物分子的檢查。
近年來，通過迭代調(diào)整已建立的探針，使得工具箱已大大擴(kuò)展。這些研究中出現(xiàn)了一些“共同的主題”。例如，可以根據(jù)物理有機(jī)化學(xué)的通用原理對第一代工具的速率和穩(wěn)定性進(jìn)行調(diào)節(jié)，以適應(yīng)特定的應(yīng)用。某些修飾的效果通?？梢酝ㄟ^計(jì)算來預(yù)測。在尋找相互兼容的反應(yīng)組合時(shí)，計(jì)算分析也可能是非常重要的。
經(jīng)過數(shù)十年的生物正交化學(xué)嘗試，仍然沒有一種普遍適用的反應(yīng)。而是存在多種反應(yīng)性，而挑戰(zhàn)在于知道如何最好地應(yīng)用探針。在調(diào)節(jié)高反應(yīng)性化學(xué)官能團(tuán)方面的最新成功表明，可以利用其他邊緣官能團(tuán)來認(rèn)識(shí)生物學(xué)。不僅需要單組分反應(yīng)，而且還需要可串聯(lián)使用的生物正交化學(xué)的組合。在這方面，繼續(xù)探索獨(dú)特的反應(yīng)方式將是有用的。本綜述中重點(diǎn)介紹的策略和示例為繼續(xù)擴(kuò)展生物正交工具包提供了路線圖，將化學(xué)研究從燒瓶中轉(zhuǎn)移到生物系統(tǒng)中。
原文鏈接：doi:https://doi.org/10.1038/s41570-020-0205-0
