介紹最近發(fā)表在Nature Review Chemistry上的一篇關于生物正交反應的綜述，作者是來自University of California, Irvine的Jennifer A.Prescher教授。
生物正交化學使研究人員能夠研究生命系統(tǒng)中的生物分子。這些反應具有很高的選擇性和生物相容性，可以在許多復雜的環(huán)境中進行。但是，就像任何有機轉化一樣，沒有完美的生物正交反應。為所需的應用選擇“最合適”的反應至關重要。因此，必須有多種化學試劑可供選擇，提供各種功能比如不同的反應速率。在過去的幾年中，不僅在擴大生物正交化學的數量上，而且在為特定應用微調現有反應性方面取得了長足的進步。在這篇評論中，我們著重介紹生物正交反應開發(fā)的最新進展，重點是物理有機化學原理如何帶領探針設計。這些化學工具的不斷擴展將提供精確調整過的試劑，并用于在不同的環(huán)境中操縱形成化學鍵。
如果要全面了解生命系統(tǒng)，就需要使用工具和方法來探測其自然條件中的生物分子，長期以來人們一直使用熒光蛋白和其他遺傳標簽實現這種目的。盡管功能強大，但這些工具不適合直接監(jiān)視非蛋白質目標，包括小分子代謝物。對更具通用性的平臺的需求刺激了生物正交化學-高度選擇性反應的發(fā)展，該反應可用于共價標記活細胞以及某些情況下的活生物體中的靶標。數十年來，生物正交反應已用于可視化和分析各種生物分子。這些研究為細胞和有機體生物學的各個方面提供了基本的知識。此類研究還揭示了生物正交工具包的局限性，啟發(fā)了更多對探針反應性和選擇性的微調開發(fā)。
生物正交化學的所有應用的核心是具有化學選擇性，并與生物系統(tǒng)相容的反應性。此類反應的發(fā)展可能很困難。溶劑和溫度是固定的，反應必須在多種干擾官能團之間進行。通常不能僅僅通過加熱受體或添加更多試劑來加速反應。因此，用于微調圓底燒瓶中化學反應的方法通常無法用于生理環(huán)境，在該環(huán)境中幾乎無法更改任何參數。盡管如此，幾代化學家一直在努力控制活細胞和生物體中的鍵形成。他們的努力提供了可以在不損害生命系統(tǒng)的情況下執(zhí)行的反應。
這篇綜述評估了生物正交反應的發(fā)展，并著重于機械論如何推動該領域的發(fā)展。像其他化學領域一樣，不存在“萬用”（指可以通用于所有情況）的反應。相反，每個反應都有其優(yōu)點和缺點，其局限性繼續(xù)推動著新的進步。在第一部分中，我們提供了生物正交化學的簡要歷史，并介紹了早期探針開發(fā)的常見策略。然后，本綜述的大部分內容展示了生物正交反應設計的最新成就。我們還著重介紹了可同時用于多組分標記的生物正交化學的工作。這些以及其他創(chuàng)新將繼續(xù)擴大生物相容性和相互正交的試劑的范圍。
經典的生物正交變換
化學家依靠強大而通用的反應來制備復雜的分子。擬定合成路線時要考慮到試劑的可得性，產率和選擇性。理想情況下，反應應該速率快，選擇性好，同時適用于多種底物。實際上，大多數反應不是普遍有效的，需要在不同情況下對溫度，pH或化學計量進行調整。催化劑和溶劑的種類也多種多樣，以優(yōu)化收率。反應范圍的限制通常成為新轉化的關鍵。發(fā)現反應和改進反應的這種反復循環(huán)提供了在各種情況下控制鍵形成的綱要方法。在某些情況下，已經開發(fā)了成百上千的專門試劑來解決反應范圍的缺陷。
考慮到某些因素，迭代優(yōu)化也已用于調整用于生命系統(tǒng)的試劑（圖一）。正交生物官能團必須在動力學和代謝上穩(wěn)定，但在生理條件下必須與互補探針快速反應。反應還必須耐受水和其他生物官能團。細胞和組織中的限制也排除了許多有機反應。幾種生物學應用也需要試劑的空間“足跡“盡可能的小。因此，開發(fā)小體積的化學試劑是另一個重要目標。
圖1 | 將反應從圓底燒瓶轉移到生物系統(tǒng)。細胞和組織中使用的反應物（橙色球和?。┍仨毰c細胞功能兼容。具有挑戰(zhàn)性的應用繼續(xù)推動著生物正交反應的發(fā)展。盡管在燒瓶中易于控制的變量在活體系統(tǒng)中通常是不變的，但在燒瓶或細胞中的優(yōu)化都遵循相似的原理。
那么，我們從哪里開始呢？尋找異源生物中不常見的官能團是一個很好的起點。微生物，植物和其他物種通?？梢允褂貌溉閯游锛毎胁淮嬖诘幕瘜W和功能。這些基本單元可以在生物環(huán)境中生存，并且與哺乳動物系統(tǒng)立即正交，從而使其成為生物正交化學的有吸引力的候選對象。一個典型的例子是炔烴，它存在于許多微生物代謝產物中，而在高級真核生物中卻不存在。炔已在許多環(huán)境中被用作生物正交基本單元。流行的生物正交官能團還包括一些來自于合成化學的不太討喜的候選物。傳統(tǒng)上，有機疊氮化物和張力炔烴對于在生物系統(tǒng)中使用而言過于不穩(wěn)定，但是經過細微的調整后，已經成為本領域公認的標準試劑。這些示例為后續(xù)試劑開發(fā)提供了重要的經驗。在本節(jié)中，我們簡要介紹一些看似“不合適”的官能團如何成為生物正交化學的兩種最常見類別的基礎：極性反應和環(huán)加成（圖二）。我們重點介紹了這些探針開發(fā)的早期障礙和關鍵進展，這些初步成功為試劑的持續(xù)改進提供了路線圖。
圖2 | 調整反應以用于生物應用。 生物正交化學主要分為兩類：極性反應（A部分）和環(huán)加成反應（B部分）。顯示了限制（以紅色突出顯示）如何刺激新反應（以綠色突出顯示）的發(fā)展的示例。
極性反應
醛和酮是最早用作生物正交標記的試劑。對生物分子標記來說，這些羰基由于小尺寸和在生物系統(tǒng)中的相容性而具有吸引力。而且，這些親電試劑還容易與α-親核試劑如酰肼和氨氧基縮合（圖二Ab）。醛和酮的縮合反應已用于標記多種生物分子。然而，該反應對pH敏感，并且在生理環(huán)境中相當慢。苯胺催化劑可以提高反應速率，但是在細胞環(huán)境中反應仍然很難進行。
盡管醛和酮在細胞中的使用較少，但只有少數其他生物正交官能團可與它們的最小尺寸相媲美。其中最具影響力的是有機疊氮化物。該官能團是非生物的，僅包含三個原子。疊氮化物在生物環(huán)境中非常惰性，但具有獨特的反應活性。例如，它們可以與軟親核試劑反應，包括三芳基膦（通過Staudinger還原反應）。該反應通過氮雜-葉立德中間體進行，該中間體可被相鄰的親電試劑捕獲。Bertozzi及其同事利用此功能，在膦上安裝了一種酯，以捕獲氮雜葉立德（圖二Ad）。反應最終通過酰胺鍵將兩種反應物連接起來。這種變體（稱為施陶丁格連接法）適合在各種復雜環(huán)境（包括活細胞）中標記疊氮化物。早期的亮點應用是多糖和蛋白質翻譯后修飾，此后還靶向了許多其他生物分子。施陶丁格連接法也是用于活體嚙齒動物的第一個此類反應，這是一種特別苛刻的環(huán)境。
施陶丁格連接的多功能性推動了反應發(fā)展的整個領域。許多早期研究的目的是提高鏈接反應的速率。盡管施陶丁格的連接牢固到足以在體內標記多糖和其他生物分子，但緩慢的反應速率卻對嚙齒動物和高等生物的影像學研究具有挑戰(zhàn)性。需要大量試劑可以以在合理的時間尺度上驅動共價鍵的形成，但由于許多膦探針的水溶性有限，因此這樣的濃度并不容易實現。這些缺點通常使施陶丁格連接在體內的應用受限，但其啟發(fā)了有機疊氮化物的其他類型的轉化。
環(huán)加成。
環(huán)加成因其出色的化學選擇性而成為流行的生物正交反應（圖二Ba）。最早利用的方法之一是[3 + 2]與疊氮化物的環(huán)加成反應。除了是溫和的親電子試劑外，有機疊氮化物是1，3-偶極子，可與炔烴反應。由于炔烴在高級真核生物中很少見，因此它們是正交的。然而，疊氮化物-炔烴環(huán)加成通常需要高溫或高壓，以及與生物不相容的條件。一個關鍵的突破是發(fā)現可以使用一價銅加速環(huán)加成反應（圖二Bb）。銅催化的疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應（CuAAC）在化學生物學和其他學科中無處不在，并且仍在激發(fā)新的應用。一價銅的細胞毒性阻止了其在體內的應用，因此人們開發(fā)出許多生物友好的催化劑。其中許多水溶性配體具有可穩(wěn)定一價銅并防止活性氧物種形成的功能。尤其是，聚三氮唑配體使CuAAC反應能夠在活細胞和斑馬魚中進行。
銅催化劑帶來的限制也啟發(fā)了化學家設計新的方法來連接1,3-偶極子。最有效的方法之一是依靠張力能使炔烴從其正常的線性幾何形狀彎曲。發(fā)現在不存在銅催化劑的情況下，環(huán)辛炔是可與疊氮化物反應的最小的穩(wěn)定環(huán)炔烴。這項工作引出了張力促進的疊氮化物-炔烴環(huán)加成（SPAACs）的整個系列（圖二Bc）。此類反應已廣泛用于復雜的生物環(huán)境中，包括植物，秀麗隱桿線蟲和小鼠。盡管SPAACs反應可最大程度地降低在生物系統(tǒng)中的毒性，但某些炔烴會與生物硫醇反應。而且，在反應性最強的張力炔烴上觀察到最快的反應速度約為1 M-1s-1，這不適用于某些體內應用。
為了兼顧反應速度和生物相容性的需求，化學家已經開發(fā)了其他環(huán)加成物。一類值得注意的是包括逆電子需求的Diels-Alder（IEDDA）環(huán)加成反應（圖二Bd）。四嗪與反式環(huán)辛烯（TCO）之間的IEDDA反應尤為突出（圖二Be）。這對之間的反應速度比最活躍的SPAACs對快106倍。由于僅需要少量物質來驅動共價鍵形成，因此這種快速轉化已在細胞和生物中廣泛使用。四嗪-TCO環(huán)加成反應的有利動力學特征使得科學家能夠探索新的體內影像學平臺，包括正電子發(fā)射斷層掃描和其他方式。四嗪-TCO反應也已廣泛用于標記生物分子，釋放前藥和激活酶，
調整生物正交反應
盡管在過去的二十年中，科學家在生物正交反應設計方面取得了令人矚目的成就，但局限性仍然存在。許多試劑在最苛刻的生物學環(huán)境中使用時不夠穩(wěn)定，或者在體內應用中反應緩慢。而且，盡管許多反應在單個目標上都能很好地起作用，但是由于存在交叉反應性問題，大多數不能組合使用來標記多個目標。因此，同時追蹤多種生物分子仍然是一個長期的挑戰(zhàn)?？偠灾?，這些局限性表明了不僅需要開發(fā)新的反應，而且還需要對現有的化學物質進行微調。下一節(jié)將重點介紹解決填補生物正交工具中的空白和擴大反應性多樣性的最新方法（圖二）。
調整極性試劑和反應。
如上所述，一些最早的生物正交轉化涉及羰基和α-親核試劑的縮合反應。這些反應的可逆性給生物分子標記帶來了挑戰(zhàn)?？茖W家已經努力建立更穩(wěn)定的加合物，包括使用臨位穩(wěn)定基團。一個重要的例子是硼酸（圖二Ac）。這些官能團可以協(xié)助例如腙和肟形成加合物，并防止水解。硼酸還被用來穩(wěn)定由其他α-親核試劑形成的連接加合物，以及標記肽和小蛋白上的N端半胱氨酸殘基。
與疊氮化物的極性反應也已針對特定應用進行了調整。施陶丁格連接是早期的優(yōu)化目標，其工作重點是提高反應速率和試劑溶解度。在疊氮化物上引入吸電子基團或在膦上引入給電子基團可提高連接速度。例如，具有氟和氯取代基的缺電子芳基疊氮化物的速率比未取代的芳基疊氮化物的速率更快。有趣的是，在這些情況下形成的氮雜-內酰胺是穩(wěn)定的加合物，無需利用膦形成親電子陷阱。此后，鹵代芳基疊氮化物已被用于標記活細胞中的多糖和蛋白質，合成適合于施陶丁格連接的富電子膦并不那么簡單，更多的親核骨架可以減少蛋白質中的二硫鍵并易于快速氧化。出于這種目的，許多膦探針已針對細胞和其他應用進行了調整。
為了提高生物相容性，還對膦試劑進行了調整。例如，Ren等人合成的包含氟磺酸酯的膦（圖二Ae）。這種處理方式類似于原始的施陶丁格連接中利用酯捕獲氮雜-葉立德。在水解并排出氟化物后，該連接產生了氨基磺酸酯。與最初的施陶丁格連接探針相比，改性的膦在水溶性上得到顯著改善，氨基磺酸酯產品還可以模擬許多生物分子和代謝物中存在的磷酸骨架。
科學家還調整了完全不同的磷親核試劑的疊氮化物連接。例如，磷酸酯和亞膦酸酯與芳基疊氮化物反應以分別提供氨基磷酸酯和氨基亞膦酸酯加合物。這些反應可用于通過多種探針選擇性修飾蛋白質和其他生物分子。
調整的膦也已在其他化學領域得到開發(fā)。例如，膦可以與邁克爾受體反應并形成穩(wěn)定的磷加合物。這種反應已被用于標記生物分子。例如，三（2-羧乙基）膦（一種廣泛用于生物學的水溶性還原劑）與缺電子的烯烴反應。該反應用于研究活細胞中的蛋白質糖基化和組蛋白上的巴豆?；?。
環(huán)磷烯酮衍生物（CpX，其中X為O，S或Et2N+）是膦連接試劑中的最新成員。當X 為氧時，連接先經過基礎的邁克爾加成反應，然后開環(huán)形成活性乙烯酮-內酯（圖三）。該乙烯酮可被膦上的鄰位親核試劑捕獲，從而提供α，β-不飽和羰基。由于單取代的CpOs易于與生物學上相關的硫醇反應，所以已發(fā)展了許多具有雙取代官能團的生物惰性骨架。這些最新的試劑可用于活細胞。
圖3丨環(huán)丙烯酮衍生物的反應性 環(huán)丙烯酮（CpX）衍生物表現出獨特的反應活性，具有氧或硫原子（分別為CpO和CpS）的類似物通過乙烯酮-葉立德中間體與膦反應。相比之下，含氮骨架（CpN+）反應形成含膦雙環(huán)。
CpOs的反應性可以通過雜原子置換來進一步調節(jié)，這是在生物正交化學中調整探針的常用策略。CpO的硫變體，環(huán)丙烯硫酮（CpS）也可以通過硫代乙烯-葉立德中間體與膦快速反應， 硫羰基類物質是研究蛋白穩(wěn)定性和功能的生物物理學探針。還已經探索了CpO的氮雜類似物，有趣的是，環(huán)丙銨（CpN+）離子作為生物正交試劑，CpN +離子通過與CpO或CpS衍生物不同的機理與膦反應。先通過邁克爾加成反應生成烯胺，該烯胺經過質子轉移而不是開環(huán)生成含磷雙環(huán)（圖三）。因此，核心骨架的微小變化會對反應性產生深遠影響。
調整偶極子用于生物正交環(huán)加成
疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應仍然是用于檢驗生物系統(tǒng)的最流行的1,3-偶極環(huán)加成反應之一。這個成功的連接為探索新的1,3-偶極子提供了靈感。這類化合物包括“硝酮”（圖四a），它比疊氮化物與某些炔烴反應更快。類似于疊氮炔烴加成，硝酮炔烴環(huán)加成反應也可以經由銅催化。這些反應已用于成像糖代謝和受體-哺乳動物細胞中的配體相互作用以及細菌中的肽聚糖結構。
生物正交偶極子集的另一個新面孔是悉尼酮（sydnone）。該1，3-偶極炔烴反應生成吡唑加合物。盡管最初的應用需要銅催化，但隨后的工作發(fā)現化合物也能夠與張力炔烴進行無銅反應。悉尼酮可以通過修飾以調節(jié)其在生物學應用中的反應性。例如，氯取代的悉尼酮與常見的張力炔烴，雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）的反應速率提高了30倍。氟取代進一步提高了悉尼酮與各種張力炔烴的反應速率
重氮化合物，一種有機疊氮化物的近親也已被類似地調整為偶極子，并用于生物正交應用。重氮基團的小尺寸在生物分子標記具有吸引力，但長期以來人們一直認為此類官能團對于細胞而言反應性太強。但是，重氮官能團與芳基類或吸電子基團（例如酯或酰胺）結合時是穩(wěn)定的。重氮化合物與張力炔烴的反應速率數倍于相應的疊氮化類似物反應。重氮-環(huán)辛炔反應已用于標記細胞的多糖以及其他靶標。重要的是，所得吡唑加合物對幾種生物親核試劑穩(wěn)定。此外，這類重氮物已提供了與非環(huán)缺電子烯烴反應的骨架，可以在疊氮化物存在下進行的反應。
更具反應性的1,3-偶極子也已被用于生物正交應用。反應物被隱藏，直到施加了外部觸發(fā)（通常是光），才能使反應物按需釋放。腈亞胺（Nitrile imines）就是這類偶極子， 它與張力烯烴（如降冰片烯和環(huán)丙烯）發(fā)生強烈反應，但在沒有連接目標的情況下會快速水解?？梢詫㈦鎭啺锋i住以獲得在生物環(huán)境中更穩(wěn)定的官能團，例如四唑或悉尼酮，然后使用紫外線照射來釋放活性物種?？梢葬槍Σ煌ㄩL的光調控起始四唑發(fā)色團的光解作用（即腈亞胺釋放）。這種新增的控制方法激發(fā)了對其他“光點擊”反應的探索，以擴大生物正交化學的研究范圍。腈亞胺還通過電子和位阻修飾得到了廣泛的修飾。
為生物正交環(huán)加成而調控親偶極子試劑
以張力環(huán)炔烴這種親偶極子試劑為例，說明對生物正交環(huán)加成的調控。為了提高反應速率或提高環(huán)的穩(wěn)定性，已經進行了大量的努力來修飾張力環(huán)。例子包括調節(jié)環(huán)的大小或構象，電子擾動，內環(huán)雜原子的安裝及其組合（圖四b）。還為增加這些脂肪族探針的水溶性做出了巨大努力。已經研究了雜環(huán)衍生物（最多12元環(huán)）雜原子變體通常更水溶性和穩(wěn)定。但是，擴環(huán)的好處是以犧牲速率為代價的：這是生物正交試劑調整中普遍存在的折衷方案?？紤]到兼顧反應性和穩(wěn)定性，BCN是一種更具影響力的環(huán)炔烴。與環(huán)辛炔相比，該骨架具有更大的張力（由于稠合的環(huán)丙烷環(huán)），但在細胞環(huán)境中非常穩(wěn)定。加上其合成的可得性，BCN已成為幾個領域中用于環(huán)加成反應的主要張力炔烴。在最近的例子中，BCN-熒光團綴合物用于活細胞的超分辨率成像（圖四c、d）。 FtsZ是一種參與細菌細胞分裂的蛋白質，通過酶化學處理裝上疊氮化物。隨后用細胞可滲透的BCN衍生物（帶有光開關的若丹明）進行處理，可以觀察到蛋白質的定位模式。
圖4丨用于偶極環(huán)加成反應的一系列試劑。a丨各種1,3-偶極子可用于生物正交標記。有機疊氮化物是最早被用于細胞中環(huán)加成反應的物質。最近，已經開發(fā)出重氮，亞砜和硝酮官能團用于生物分子標記。高反應性偶極（包括一氧化二氮，亞胺和乙叉化物）也是可行的連接子，通常通過光解或化學解籠作用“按需”生產。b丨可用于生物正交環(huán)加成的幾種類型張力炔。這些試劑來來源于環(huán)辛炔的變體。對環(huán)辛炔的廣泛修飾提供了具有可控反應性的試劑組合。c丨在生物正交環(huán)加成中的示例應用。FtsZ。一種參與細胞分裂的細菌蛋白配有疊氮化物提手。隨后與雙環(huán)[6.1.0]壬炔（BCN）-可光轉換的熒光團結合物的連接使得在活大腸桿菌中能夠進行超高分辨率顯微鏡檢查。d | FtsZ在活大腸桿菌中定位的衍射極限熒光（左）和超分辨率（右）顯微鏡圖像。插圖顯示細菌細胞的明場圖像。
通過使用計算化學方法，科學家更易于調控環(huán)炔的反應性。計算化學可以同時預測空間結構和電子特征，調控骨架以獲得所需的結果。一種完整的調節(jié)環(huán)加成反應對的方法依賴于畸變/相互作用模型。該分析通過計算形變能（即反應物通過理想的過渡態(tài)幾何結構所需的能量）和相互作用能（與兩個反應物分子之間的軌道重疊有關）之間的差來計算給定反應的激活勢壘。然后將計算出的活化能與預測的速率常數相關聯(lián)，該常數最終可以指導調控試劑?；?相互作用模型在生物正交試劑設計中的最早應用之一涉及一系列的雙芳基環(huán)辛炔酮類似物。這項研究揭示了阻礙雙芳基環(huán)辛炔酮與疊氮化物反應的結構特征，并為開發(fā)改進的環(huán)辛炔奠定了基礎。除其他生物正交環(huán)加成反應外，類似的計算研究已用于微調悉尼酮-環(huán)炔反應。
調整親二烯體的生物正交環(huán)加成反應
近年來，IEDDA反應領域的并行發(fā)展進一步擴大了生物正交化學的數量。特別是具有TCO的反應已在細胞和體內中廣泛使用。這樣的轉化也已經成為廣泛的試劑調控的目標。大量的努力集中在加速四嗪TCO連接的動力學上（圖五）。假設增加TCO張力可提高反應速率，類似于偶極環(huán)加成中炔烴的應力作用。為此，Fox及其同事設計了一種骨架，其中TCO被迫采用半椅構型（包括帶有二氧戊環(huán)的TCO（d-TCO）和張力的TCO，稱為s-TCO）。預計這些官能團的能量比TCO的冠狀構象高5.6-5.9kcal mol-1。反應性更強的d-TCO和s-TCO變體顯示的雙分子速率常數高達3x 106M-1s-1。
與張力炔烴相似，對張力烯烴也采用了環(huán)收縮策略。例如，反式環(huán)庚烯（TCH）類似物是IEDDA與四嗪類環(huán)加成反應中的強親二烯體。TCH在環(huán)境條件下易于異構化，但可以與一價銀形成穩(wěn)定的復合物并被分離出來。另外，結合內環(huán)硅原子可以制備產生更穩(wěn)定的七元環(huán)烯烴sila-TCH（SiTCH）。SiTCH中較長的Si-C鍵長度可減輕某些環(huán)張力，從而較容易實現分離。計算化學研究表明，SiTCH與二苯基四嗪的反應活化障礙明顯低于s-TCO，從而可以快速連接。SiTCH和模型四嗪的二級速率常數為1.14x 107M-1s-1，是有記錄以來最快的生物正交連接。然而，盡管它們的速率很高，但是在存在細胞硫醇的情況下，TCH和SiTCH會迅速降解。
圖5丨用于IEDDA反應的張力烯烴的示例。親二烯體已被廣泛地調控以調節(jié)反電子需求的Diels-Alder（IEDDA）與四嗪的環(huán)加成反應的速率。反式環(huán)辛烯（TCO）是典型的親雙烯體。對TCO進行了修釋以獲取反應速度更快，更具生物相容性的試劑。一些骨架具有內環(huán)雜原子（DOTCO，OSi-TCH和oxoTCO），構象約束（二氧雜TCO（d-TCO）和張力TCO（s-TCO））和收縮環(huán)（反式環(huán)庚烯（TCH）和sila-TCH （SiTCH））。通常，在存在生物硫醇的情況下，最快的反應骨架表現出最短的半衰期（t1/2）。PBS為磷酸鹽緩沖溶液。
1,3-二取代的環(huán)丙烯，作為IEDDA反應的替代性親二烯體，也已針對各種應用進行了調控。Nguyen和其他人報道這些骨架可在生物環(huán)境中與四嗪反應。與TCO相比，四嗪和環(huán)丙烯之間的反應要慢得多，但是，環(huán)丙烯的小尺寸和細胞穩(wěn)定性使其在復雜環(huán)境中對生物分子的研究具有吸引力。Chin及其同事的一個著名例子使用了環(huán)丙烯賴氨酸類似物來監(jiān)測果蠅中新生的蛋白質生物合成。
改變環(huán)丙烯的空間結構會顯著反應性。使用畸變/相互作用模型可以預測，環(huán)丙烯C3位的空間體積增加會大大降低其與四嗪的反應性。反應性降低歸因于過渡態(tài)的幾何約束。預測環(huán)加成反應物種之間的軌道重疊阻礙會減慢連接速度。的確，即使3,3-二取代的環(huán)丙烯經受各種官能化的四嗪，也沒有實驗觀察到反應，但是3,3-取代的環(huán)丙烯仍然與腈亞胺反應，這種差異反應性被用來串聯(lián)標記兩種蛋白質。
通過在C3引入螺環(huán)可以進一步調控環(huán)丙烯。根據晶體學數據，與母體環(huán)丙烯1相比，環(huán)丙烯2在兩個C3基團之間的鍵角減小（圖六a）。減小的鍵角使取代基遠離引入的腈亞胺，并使反應速率增加15倍（圖六b）。螺環(huán)環(huán)丙烯還顯示出與某些四嗪的反應性，并已被用于標記活細胞中的細胞表面受體。螺環(huán)內的雜原子通過降低LUMO能量進一步提高了環(huán)丙烯的反應性。最新的研究中為螺環(huán)環(huán)丙烯裝配了光敏籠。打開開關后骨架可用于IEDDA連接。這些被鎖住的試劑同時對生物分子進行時間-空間上的標記，但其合成仍然具有挑戰(zhàn)性。
還已經研究了四嗪作為其他生物相容性環(huán)加成反應的反應物，例如涉及異腈的轉化。這些親二烯體通過[4 + 1]環(huán)加成與四嗪反應生成亞胺產物。對于伯、仲異腈，所得的亞胺容易進行互變異構化和水解，從而釋放出胺。事實證明，此類異腈可用作氨基熒光團和小分子藥物的籠子。適當調控的異腈可以減輕水解，例如，叔異腈與四嗪反應形成穩(wěn)定的連接加合物，因為它們無法進一步反應。由于其體積小，用途廣泛，因此已被用于標記生物分子，包括蛋白質和多糖。
簡單的乙烯基也與四嗪探針進行IEDDA反應。乙烯基基序的小尺寸對于生物分子標記策略具有吸引力。然而，即使使用富含電子的乙烯基試劑，迄今為止所檢查的大多數烯烴都具有較低的水溶性和較慢的反應速率。相比之下，乙烯基硼酸（VBA）與四嗪的反應明顯更快。反應釋放出硼酸，這是該反應的主要驅動力。配備富電子的VBA和配有羥基的四嗪（與硼酸基序配位）可實現更快的環(huán)加成反應，VBA-四嗪連接已被用于剖析蛋白酶體抑制劑在活細胞中的功效。已對許多其他環(huán)狀烯烴和丙烯酸烯烴進行了與四嗪反應的研究。
圖6 | 立體修飾可調節(jié)環(huán)丙烯的反應性。a丨與母體化合物1相比，螺環(huán)環(huán)丙烯2中C3取代基之間的夾角減小。b丨減小的鍵角將過渡態(tài)的空間碰撞減至最小，從而加快了與腈亞胺的反應。krel為相對速率常數。
調控二烯體的生物正交環(huán)加成反應
IEDDA反應的另半部分，即二烯（通常為四嗪）也已被修飾以改變穩(wěn)定性和反應性（圖二Bf）。在一實施例中，通過電子攝動來調節(jié)四嗪探針的穩(wěn)定性。最初發(fā)現含有四嗪官能團的氨基酸在細胞環(huán)境中水解， 不穩(wěn)定的仲胺鍵促進了水解，給電子胺基團也減慢了IEDDA反應速度。去除”胺把手”解決了這兩個限制。在另一個實例中，合成了平面四嗪以促進胺的快速釋放與TCO反應。用帶有TCO籠的氨基酸的模型酶篩選四嗪，最好的四嗪類化合物在少至50 μM的濃度下，可在4分鐘內完成幾乎定量的反應。
在生物正交化學中，某些四嗪反應所達到的速率是無與倫比的。然而，如此高的速率通常以探針穩(wěn)定性為代價。許多最具反應性的四嗪與硫醇反應，可導致脫靶效應和細胞中高背景標記物。為了解決這一問題，一些研究小組從籠狀生物正交試劑中汲取了靈感，這些工作集中于利用官能團的氧化還原特性原位釋放活性四嗪。還原性二氫四嗪對親二烯體無反應，在生物環(huán)境中穩(wěn)定。然后可以使用酶法或光催化法將二氫四嗪原位氧化為四嗪。這樣的策略甚至可以將最具反應性的四嗪應用于生物環(huán)境中。鎖在籠中的四嗪也已被用于用生物分子修飾電極表面。
一些四嗪官能團的不穩(wěn)定性激發(fā)了對缺電子性較弱的二烯的探索，包括1,2,4-三嗪。像它們的四嗪類似物一樣，三嗪通過IEDDA與張力的π系統(tǒng)（例如TCO和BCN）反應。盡管這些反應的速度明顯慢于四嗪，但三嗪可以在存在生物硫醇的條件下在升高的pH值下穩(wěn)定超過24小時。此后，這些骨架被安裝在蛋白質中，并在體外酶促地附著在DNA上。1,2,4-三嗪還經過電子調諧，以實現更快的動力學活性。例如，吸電子吡啶鎓基團已被用于增加環(huán)加成速率。這些骨架已被用于標記活細胞中的線粒體。對三嗪核的微小空間修飾也改變了與張力炔烴的反應方式。在最近的研究中，畸變/相互作用模型預測C3和C6處的三嗪取代將減少與空間位阻大的張力炔烴的反應性。為了使成鍵中心（也就是C3和C6）的空間碰撞減至最小，預測此類反應仍可使用C5取代的異構體進行。通過同時、雙重標記兩個蛋白質靶標的實驗證實了這些預測。
可以參與IEDDA環(huán)加成反應的二烯的數量也在增加。最近顯示，含氮雜環(huán)4H-吡唑可與張力的BCN反應。首先，吡唑需要調控以提高反應速率， 通過添加氟取代基通過逆向的超共軛作用增加了骨架的抗芳香族特性。吡唑環(huán)的這種失穩(wěn)將因此導致更快的連接。計算分析證實，偕二氟基團會降低4H-吡唑的LUMO能量，從而導致與BCN的快速反應性。沿著反應坐標的這種抗芳香性考慮可以在生物正交反應設計中更普遍地利用。
另一類二烯包括鄰醌，張力促進的氧化控制的環(huán)辛炔與1,2-鄰醌環(huán)加成反應是一個例子。在早期迭代中，使用外源氧化劑將1,2-鄰苯二酚轉化為相應的醌。這些張力促進的氧化控制的環(huán)辛炔-1,2鄰醌反應比疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應（二階速率常數約為500 M-1s-1）快幾個數量級，并且與某些四嗪-TCO連接反應相當。后來的研究表明，可使用酪氨酸酶將可遺傳編碼的酪氨酸標簽原位選擇性氧化為醌。然后可以將這些官能團用于附加小分子以形成抗體-藥物偶聯(lián)體（ADC）。該策略使得能夠控制附著于抗體的“彈頭”的位置和數量。鄰-喹諾酮也能與諸如環(huán)丙烯之類的張力烯烴有效地反應。但是，原位生成鄰醌的要求可能會帶來一些限制。已經研究了鄰-喹啉酮醌甲基化物作為更通用的替代物，因為這些骨架可以在生物環(huán)境中原位產生而無需外部觸發(fā)。這些官能團通過雜Diels-Alder環(huán)加成反應與乙烯基硫醚強烈反應，形成不尋常的硫縮醛加合物，并在各種pH值下在水溶液中均穩(wěn)定。
結合相互正交的反應
從上面可以明顯看出，過去十年來，可用于生物應用的化學反應數量激增。盡管工具包已擴展，但一次應用多個反應仍然具有挑戰(zhàn)性。新反應的開發(fā)主要集中在標記單個目標上。鑒定生物正交化學的相容組合將使多組分標記研究成為可能，從而拓寬了可以檢查的生物過程的范圍。從歷史上看，找到這樣的反應組合一直是一項挑戰(zhàn)，因為許多常見的試劑會相互交叉反應。近年來，借助計算化學和反應調節(jié)，人們對正交反應的搜索已大大加快。
具有獨特機理的生物正交反應非常適合于多組分標記研究。具有不同反應模式的試劑通?？梢跃徑饨徊娣磻獑栴}。例如，疊氮化物-炔烴環(huán)加成可與肼-酮縮合、各種IEDDA試劑、一些1.3偶極子和其他官能團串聯(lián)使用。還研究了使用三個相互兼容的生物正交基團的策略，以三標記法為例，該方法以含疊氮化物，含環(huán)丙烯和炔烴的糖為特征，研究植物細胞中糖代謝的異質性。但是，由于反應物種之間的交叉反應性，無法同時進行連接。連接之間還需要進行笨拙的洗滌，從而破壞了時間尺度上的分辨率。迄今為止，只有三項研究同時進行了三重標記。一個例子是使用兩種四嗪：一種在空間上受阻并與少量異腈選擇性反應，另一種在典型的IEDDA環(huán)加成反應中將TCO連接起來。將四嗪反應與疊氮化物-張力的炔烴對合并以進行三重標記?；旌先N模型蛋白，分別用大體積的四嗪，空間位阻較小的四嗪或疊氮化物標記，并與與異腈，TCO或張力炔偶聯(lián)的光譜分辨熒光團反應。通過凝膠內熒光檢測匹配的加合物，沒有交叉反應的跡象（圖七）。盡管這項研究僅在模型環(huán)境中展示了三組分標簽，但該試劑應也適用于其他生物學環(huán)境。
圖7丨結合生物正交化學進行多組分標記。a |有三個不同的反應：[4 + 1]四嗪（Tz1）-異腈環(huán)加成，[4 + 2]四嗪（Tz2）-反式環(huán)辛烯（TCO）環(huán)加成和[3 +2]疊氮化物-二苯并環(huán)辛炔（DBCO）環(huán)加成 用于同時標記三種模型蛋白（牛血清白蛋白（BSA），卵清蛋白（OVA）和溶菌酶（LYSO））。b |通過凝膠電泳，然后進行熒光掃描，觀察共價蛋白加合物。沒有檢測到交叉反應。
探索新的反應類型
以識別為目的其他類型的生物正交化學將繼續(xù)支撐多組分標記研究。最近探索化學空間新領域的努力和對現有連接的其他調整是富有成果的， 硼試劑在這方面已受到關注。在一實例中，二硼探針與N-氧化物選擇性反應。重要的是，連接是在最嚴苛的生物環(huán)境之一的細胞內有效進行的。該反應的獨特機理也與幾種現有的生物正交化學相容。
極性試劑設計中最值得注意的發(fā)展也許涉及到六價硫氟化物。這些官能團在細胞環(huán)境中非常穩(wěn)定，并通過六價硫氟化物交換（SuFEx）化學與氧或氮親核試劑發(fā)生強烈反應。SuFEx試劑已用于基于藥物設計、活性蛋白和其他蛋白質靶向研究。它們也已用于通過鄰近驅動的交聯(lián)來檢查蛋白質-蛋白質相互作用。SuFEx親電試劑還提供了一種溫和方便的方法，可將生物正交疊氮化物引入各種胺靶標，進一步例證了這些官能團的用途。
對新的環(huán)加成平臺的探索也正在擴展生物正交工具包。一個例子涉及四環(huán)庚烷額連接。 該反應是與鎳-雙（二硫代戊二烯）配合物的 [2σ+2σ+2π]環(huán)加成反應，這是一種獨特的反應方式。四環(huán)庚烷是高度張力的分子（張力能約為80 kcal mol-1），但可以在水溶液條件和存在硫醇的環(huán)境中穩(wěn)定較長時間。四環(huán)庚烷甚至已通過遺傳密碼擴展用于細胞內標記應用。四環(huán)庚烷反應的新穎性可能會激發(fā)繼續(xù)探索其他用于生物正交應用的環(huán)加成組合。
生物正交反應也已經擴展到包括過渡金屬。這些金屬實際上在細胞環(huán)境中不存在，并且可以形成穩(wěn)定的C-C鍵，從而使其對選擇性標記應用具有可行性。關于此主題的重點評論可以在其他地方找到，但我們在下面重點介紹一些著名的例子。水溶性一價金絡合物已被開發(fā)來驅動在水性介質中形成共價鍵。金納米顆粒也已用于斑馬魚的成像。盡管金屬絡合物必須與骨架蛋白結合，但是可以利用更多反應性的二價金物種進行選擇性酰胺化反應。受銅催化的啟發(fā)，幾個研究小組對配體進行了優(yōu)化，以形成水溶性，毒性最小的鈀配合物。一些已被用于細胞中的Suzuki-Miyaura偶聯(lián)，以及Sonogashira反應和炔基-氨基甲酸酯脫保護。鈀納米顆粒和其組件也已經被開發(fā)用于在纖維素中進行各種轉化。釕化學和銥光催化學方面的類似進展使生物分子靶向成為可能。
蛋白質生物共軛技術的新發(fā)展也被用于更普遍的生物正交應用。例如，芳基重氮離子是與富電子芳族側鏈（例如酪氨酸）強烈反應的親電子試劑。由于蛋白質中酪氨酸殘基的豐度，使用芳基重氮進行特定位點修飾在歷史上具有挑戰(zhàn)性。進一步的研究揭示了5-羥基色氨酸與芳基重氮試劑之間的選擇性反應。5-羥色氨酸中額外的電子密度使得能夠使用反應性較低的重氮試劑，從而防止了其他芳香族側鏈（例如酪氨酸）的背景標記。此反應此后已用于標記重組蛋白和抗體衍生物，并且預期會有其他靶標。其他蛋白質標記策略的進一步調控可能會提供更多的生物正交試劑。
總結
生物正交化學的核心是在嚴苛環(huán)境下控制反應性官能團。如何設計一對試劑以在細胞或整個生物體內形成單一加合物？對這些反應的嚴格要求經常迫使研究人員探索非常規(guī)的方法。歷史性的工作提供了一套初始試劑，其中許多試劑仍用于體內生物分子的檢查。
近年來，通過迭代調整已建立的探針，使得工具箱已大大擴展。這些研究中出現了一些“共同的主題”。例如，可以根據物理有機化學的通用原理對第一代工具的速率和穩(wěn)定性進行調節(jié)，以適應特定的應用。某些修飾的效果通常可以通過計算來預測。在尋找相互兼容的反應組合時，計算分析也可能是非常重要的。
經過數十年的生物正交化學嘗試，仍然沒有一種普遍適用的反應。而是存在多種反應性，而挑戰(zhàn)在于知道如何最好地應用探針。在調節(jié)高反應性化學官能團方面的最新成功表明，可以利用其他邊緣官能團來認識生物學。不僅需要單組分反應，而且還需要可串聯(lián)使用的生物正交化學的組合。在這方面，繼續(xù)探索獨特的反應方式將是有用的。本綜述中重點介紹的策略和示例為繼續(xù)擴展生物正交工具包提供了路線圖，將化學研究從燒瓶中轉移到生物系統(tǒng)中。
原文鏈接：doi:https://doi.org/10.1038/s41570-020-0205-0
