自然殺傷（NK）細(xì)胞是可以殺死某些類型癌細(xì)胞的免疫細(xì)胞。其不僅與抗腫瘤、抗病毒感染和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，而且在某些情況下還參與超敏反應(yīng)和自身免疫性疾病的發(fā)生。NK細(xì)胞的過(guò)繼轉(zhuǎn)移是一種針對(duì)惡性腫瘤的新型免疫療法，識(shí)別靶細(xì)胞后，其可使細(xì)胞溶解的顆粒酶釋放到靶細(xì)胞，從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。NK細(xì)胞的抗腫瘤能力可以通過(guò)多種方式進(jìn)行體外監(jiān)測(cè)。然而，迄今為止，幾乎沒(méi)有化學(xué)探針可以直接檢測(cè)體內(nèi)腫瘤中的NK細(xì)胞活性。
基于此，英國(guó)愛丁堡大學(xué)的Marc Vendrell教授和Takanori Kitamura博士以及以色列特拉維夫大學(xué)的Doron Shabat教授合作報(bào)道了一種新型化學(xué)發(fā)光探針，其可用于顆粒酶B介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷活性研究中的原位成像。其中顆粒酶B特異性底物通過(guò)自消滅性接頭與可活化的苯氧基二氧雜環(huán)丁烷發(fā)光體偶聯(lián)，僅在存在NK細(xì)胞釋放的活性顆粒酶B的情況下才能產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光（Scheme 1）。相關(guān)成果以“A Functional Chemiluminescent Probe for in vivo Imaging of Natural Killer Cell Activity against Tumours”為題發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed.上（DOI: 10.1002/anie.202011429）。
（來(lái)源：Angew. Chem. Int. Ed.）
首先，作者基于顆粒酶B的底物-序列Ile-Glu-Pro-Asp（IEPD）設(shè)計(jì)了化學(xué)發(fā)光探針1，其主要由三部分組成：顆粒酶B可裂解的肽序列Ac-IEPD、含親電酰胺鍵的對(duì)氨基芐醇（PABA）橋連基團(tuán)和用于化學(xué)發(fā)光的苯氧基二氧雜環(huán)丁烷。1的具體合成過(guò)程如Scheme 2所示：天冬氨酸與谷氨酸的側(cè)鏈被保護(hù)為烯丙基酯，從而使C末端的羧基游離出來(lái)；使用N-乙氧基羰基-2-乙氧基-1,2-二氫喹啉（EEDQ）將羧基與PABA的苯胺基偶聯(lián)，得到化合物2；用氯代三甲基硅烷和碘化鈉處理2，得到具有更高反應(yīng)活性的化合物3；3與丙烯酸取代的酚烯醇醚反應(yīng)得到受保護(hù)的前體4；在Pd(PPh3)4和二甲基巴比妥酸（DMBA）的脫保護(hù)作用下，得到粗產(chǎn)品；最后，經(jīng)HPLC純化，得到化學(xué)發(fā)光探針1，純度高達(dá)95%以上。
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隨后，作者探究了在存在及不存在活性人重組（hr）-顆粒酶B的情況下，探針1的化學(xué)發(fā)光現(xiàn)象與時(shí)間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)探針1與酶孵育后幾分鐘內(nèi)在520 nm附近出現(xiàn)強(qiáng)烈的化學(xué)發(fā)光（Figure 1a）。作者進(jìn)一步將探針1在顆粒酶B抑制劑Ac-IEPD-CHO存在下與活性酶孵育，發(fā)現(xiàn)化學(xué)發(fā)光降低了90％以上，表明探針1的激活是由于其與顆粒酶B的反應(yīng)性所致（Figure 1a）。另外，作者評(píng)估了探針1對(duì)顆粒酶B的選擇性，結(jié)果顯示在與顆粒酶B反應(yīng)后不到10分鐘內(nèi)化學(xué)發(fā)光增加了139倍，而在其他蛋白酶存在下化學(xué)發(fā)光變化很小，僅在半胱天冬酶8和生物分子中檢測(cè)到信號(hào)（Figure 1b）。
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接下來(lái)，作者比較了探針1與具有相同肽序列的可激活熒光探針的靈敏度。市售熒光探針Ac-IEPD-AMC含有7-氨基-4-甲基香豆素基團(tuán)，經(jīng)顆粒酶B裂解后在450 nm處產(chǎn)生熒光（Figure 2a）。與活性顆粒酶B反應(yīng)30分鐘后，作者測(cè)量了探針1和Ac-IEPD-AMC的信噪比（S/N），發(fā)現(xiàn)探針1的信噪比遠(yuǎn)高于Ac-IEPD-AMC，并在不到10分鐘的時(shí)間內(nèi)達(dá)到了約100倍，而Ac-IEPD-AMC的比率始終低于5倍（Figure 2b）。
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鑒于探針1良好的體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果，作者在PhotonImager?發(fā)光成像系統(tǒng)下研究了其是否可用于檢測(cè)顆粒酶B介導(dǎo)的NK細(xì)胞對(duì)癌細(xì)胞的殺傷活性。作者將細(xì)胞孵育不同的時(shí)間，然后添加探針1并進(jìn)行免洗圖像采集（Figure 3a）。探針1在單獨(dú)的NK-92細(xì)胞和人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中均顯示出很低的發(fā)射；但在NK-92和MDA-MB-231共孵育細(xì)胞中檢測(cè)到明亮的化學(xué)發(fā)光（Figure 3b）。與NK細(xì)胞的抗癌活性相一致，作者觀察到探針1的化學(xué)發(fā)光隨著共孵育時(shí)間的增加而增加，且在8小時(shí)后檢測(cè)到最亮的信號(hào)（Figure 3c）。
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最后，作者檢查了探針1在體內(nèi)成像NK細(xì)胞活性的能力。NSG小鼠缺乏宿主NK細(xì)胞，因此可作為評(píng)估過(guò)繼轉(zhuǎn)移NK-92細(xì)胞效力的最佳模型。首先，作者向免疫受損的NSG小鼠注射人MDA-MB-231癌細(xì)胞，構(gòu)建了異種移植小鼠癌癥模型，該模型中動(dòng)物的兩個(gè)側(cè)面均接種了皮下腫瘤。隨后，作者將NK-92細(xì)胞僅注射到其中一個(gè)腫瘤。待NK細(xì)胞轉(zhuǎn)移八小時(shí)后，作者將探針1應(yīng)用于兩個(gè)腫瘤，并立即在PhotonImagerTM系統(tǒng)中進(jìn)行全身成像。結(jié)果顯示，僅在接受NK細(xì)胞注射的腫瘤中檢測(cè)到明亮的化學(xué)發(fā)光信號(hào)。另外，在未注射探針1的小鼠中同樣沒(méi)有檢測(cè)到信號(hào)（Figure 4）。
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總而言之，作者開發(fā)了一種新型化學(xué)發(fā)光探針1，其可用于快速且選擇性檢測(cè)NK細(xì)胞活性，以識(shí)別腫瘤細(xì)胞，并且其在速度和信噪比方面優(yōu)于商業(yè)熒光試劑Ac-IEPD-AMC并可用于定量檢測(cè)。此外，使用全身化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)能夠?qū)崿F(xiàn)在體內(nèi)可視化NK細(xì)胞識(shí)別的腫瘤。這項(xiàng)研究強(qiáng)調(diào)了可激活的化學(xué)發(fā)光探針在活體腫瘤中直接監(jiān)測(cè)基于NK細(xì)胞的免疫療法的有效性。
