腸道菌群合成數(shù)以百計(jì)的分子，其中許多都會(huì)影響宿主生理。在最豐富的代謝產(chǎn)物中，有次級(jí)膽汁酸脫氧膽酸（DCA）和石膽酸（LCA），已知它們能以約500μM的濃度積累阻斷Clostridium difficile的生長，促進(jìn)肝細(xì)胞癌并通過G蛋白偶聯(lián)受體TGR5調(diào)節(jié)宿主代謝。更廣泛地說，DCA，LCA及其衍生物是膽汁酸循環(huán)池的主要組成部分。該池的大小和組成是原發(fā)性膽源性膽管炎和非酒精性脂肪性肝炎的治療目標(biāo)。盡管如此，雖然DCA和LCA對(duì)宿主生理有明顯影響，但是對(duì)其生物合成基因的不完全了解以及缺乏能夠?qū)ζ涮烊晃⑸锷a(chǎn)者進(jìn)行修飾的遺傳工具，仍然限制了我們調(diào)節(jié)宿主中次級(jí)膽汁酸水平的能力。
本文通過為定性和分配在還原臂的每個(gè)步驟中的酶來完整DCA和LCA的通路，揭示了在類固醇核心的A–B環(huán)在進(jìn)行的兩個(gè)還原步驟中被瞬時(shí)轉(zhuǎn)化為電子受體的一種戰(zhàn)略，通過Fe-S黃素酶進(jìn)行兩個(gè)還原步驟。使用厭氧體外重建，我們確定一組六種酶對(duì)膽酸到DCA的八步轉(zhuǎn)化是必要和充分的。然后，我們將該途徑工程化為Clostridiumsporogenes，賦予非生產(chǎn)共生體生產(chǎn)DCA和LCA的能力，并證明微生物組衍生的途徑可以被異源表達(dá)和控制。這些數(shù)據(jù)建立了通往膽汁酸池兩個(gè)主要成分的完整途徑。
論文ID 原名：A metabolic pathway for bile aciddehydroxylation by the gut microbiome 譯名：腸道微生物對(duì)膽汁酸去羥基化的代謝途徑 期刊：Nature IF：42.778 發(fā)表時(shí)間：2020.06 通訊作者：Steven C. Almo& Michael A. Fischbach 作者單位：美國加利福尼亞州斯坦福市，斯坦福大學(xué)生物工程與化學(xué)工程學(xué)系;美國紐約州布朗克斯，阿爾伯特·愛因斯坦醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)系 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 結(jié)果
1 7α脫羥基的重建
我們首先著手取消在7位-去羥化途徑的其余步驟。由于之前的研究涉及到bai酶在大腸桿菌中單獨(dú)表達(dá)，因此我們認(rèn)為，在體外對(duì)酶進(jìn)行純化、混合和檢測的替代方法，可以幫助描繪出一組足以進(jìn)行7α-去羥基化的必要酶。考慮到8基因的bai操縱子在所有已知的7 α-羥化菌株中都是相同的，我們將精力集中在操縱子編碼的酶上。我們克隆了每個(gè)酶的三個(gè)同源物，在微氧條件下分別在大腸桿菌中表達(dá)，并厭氧純化為氨基末端His6融合物。使用這種策略,我們獲得至少一個(gè)可溶性, 純化每一個(gè)bai酶的orthologue(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖2)。當(dāng)我們孵化一個(gè)提純bai酶與膽酸的混合物時(shí),煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD) +,輔酶a和ATP在厭氧條件下和監(jiān)控反應(yīng)通過液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用(LC-MS),我們觀察到的時(shí)間依賴的膽酸到DCA的轉(zhuǎn)換,表明BaiB, BaiCD,BaiA2, ,BaiF的結(jié)合以及BaiH的簡化足以進(jìn)行7α-去羥基化;不需要額外的酶(圖2a, b)。
圖2 體外建立完整的7α-羥化通路
擴(kuò)展圖2重組Bai蛋白的純化
a，經(jīng)過Ni親和和大小排除純化后的Bai蛋白的SDS- PAGE分析，考馬斯藍(lán)染色顯示。該圖像使用Bio-RadGel Doc Universal Hood II分子成像儀生成。MWM，分子量標(biāo)記;來自C. scindens的BaiB;2、來自C.hylemonae的BaiB;3、來自C. hiranonis的BaiCD;來自C. scindens的BaiE;來自C. hiranonis的BaiE;來自C. scindens的BaiA2;7、來自C.hylemonae的BaiF;來自C. scindens的BaiH;來自C. scindens的BaiI;來自C. hiranonis的BaiI。b，紫外可見光譜，左為24μM，右為13μM。在370 nm和450 nm處的特征表明黃素與BaiCD和BaiH結(jié)合，并且部分被具有300 nm到700 nm廣泛吸光度的[4Fe 4S]簇的存在所掩蓋。c，經(jīng)質(zhì)譜分析證實(shí)FMN和FAD的存在。c區(qū)實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次，結(jié)果相似。
為了驗(yàn)證我們關(guān)于該途徑步驟順序的假設(shè)，我們進(jìn)行了逐步重建，每次添加一種酶，并允許中間產(chǎn)物在該途徑中的每一步完成(圖2c)。從這些數(shù)據(jù)中，我們得出兩個(gè)結(jié)論。首先，在重組過程中使用的六種酶不僅是充分的，而且是必要的，其途徑按照?qǐng)D2c所示的方案進(jìn)行。我們直接觀察到質(zhì)量離子與每一個(gè)提議的中間產(chǎn)物一致，為先前提出的生物合成路線的部分提供直接證據(jù)。(有關(guān)數(shù)據(jù)，請(qǐng)參閱補(bǔ)充表1及擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖3，
擴(kuò)展圖3 膽汁酸標(biāo)準(zhǔn)品
a，對(duì)于研究中我們有真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)的每個(gè)化合物，我們展示真實(shí)標(biāo)準(zhǔn)和實(shí)驗(yàn)觀察到的化合物的EIC。因?yàn)檫@里顯示的數(shù)據(jù)是從不同時(shí)間運(yùn)行的樣品中收集的，保留時(shí)間的漂移可能是造成保留時(shí)間不相同的峰對(duì)的原因。b，我們觀察到在圖2c所示的實(shí)驗(yàn)收集的LC-MS數(shù)據(jù)中保留時(shí)間有漂移。對(duì)于來自該數(shù)據(jù)集的兩個(gè)代表性化合物，我們顯示了實(shí)驗(yàn)觀察化合物的EIC和一個(gè)真實(shí)的標(biāo)準(zhǔn)同時(shí)運(yùn)行，表明保留時(shí)間與我們的峰的分布保持一致。
以支持我們的臨時(shí)的結(jié)構(gòu)分配;兩個(gè)重要的限制是，我們對(duì)所有中間體沒有真正的標(biāo)準(zhǔn)，以及LC-MS區(qū)分膽汁酸異構(gòu)體的能力是有限的。盡管其保存在所有已知的去羥化物種中，但是BaiI在體外膽酸去羥化是不可缺少的。BaiI是預(yù)測Δ5-ketosteroid異構(gòu)酶,它可以處理除了膽酸以外的底物,大概有4、5或5,6-烯烴的底物。
其次，令我們驚訝的是，BaiH的缺失導(dǎo)致通路在高氧化中間體3-oxo-4,5-6,7-dehydro-DCA處停滯，而其加入則導(dǎo)致連續(xù)兩次2e-還原形成3-oxo-DCA。此前曾有人提出BaiH可氧化一種替代底物，3-oxo-4,5-dehydro-ursodeoxycholicacid，因此在該途徑的還原臂中可能發(fā)揮的作用是意料之外的。為了進(jìn)一步探索這一發(fā)現(xiàn)，我們將純化的BaiH與合成3-oxo-4,5-6,7-dehydro- DCA孵育;我們觀察到酶催化2 e-轉(zhuǎn)為 3-oxo-4,5-dehydro-DCA,但沒有進(jìn)一步減少中間(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)。值得注意的是,3-oxo-4, 5-dehydro-DCA并不建立在包含BaiH的重構(gòu)反應(yīng)中,暗示混合物存在另一種酶催化第二個(gè)還原步驟。假設(shè),BaiH同系物BaiCD催化第二還原步驟,我們與它合成的3-oxo-4 5-dehydro-DCA孵育,揭示了它將底物拆合到3-oxo-DCA(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖4)。
擴(kuò)展圖4 BaiCD和BaiH 的動(dòng)力學(xué)參數(shù)
a, Michaelis–Menten分析了通過BaiCD將3-氧-4,5-脫氫- DCA轉(zhuǎn)化為3-氧- DCA的過程。反應(yīng)混合物包含0.45μM BaiCD和1毫摩的NADH，底物濃度在15μM和500μM之間變化。b, Michaelis–Menten分析了通過BaiH 將3-氧-4,5,6,7-二氫- DCA轉(zhuǎn)化為3-氧-4,5-dehydro-DCA的過程。反應(yīng)混合物包含0.45μM BaiH和1 mM的濃度NADH，底物濃度在3和100之間變化。數(shù)據(jù)顯示產(chǎn)物平均水平±1s.d。（三個(gè)生物學(xué)重復(fù)）
綜上,這些數(shù)據(jù)表明,該通路使用一個(gè)不尋常的氧化還原策略的A和B環(huán)類固醇核心轉(zhuǎn)換成一個(gè)高度氧化中間產(chǎn)物3-oxo-4,5 - 6, 7-didehydro-DCA;這兩個(gè)關(guān)鍵的還原步驟是由Fe-S黃素酶超家族中的兩種同源酶BaiH和BaiCD催化完成的。
最后，3-oxo-DCA還原為DCA途徑的最后一步是由BaiA2完成的，經(jīng)純化的BaiA2單獨(dú)測定證實(shí)(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5)。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖5 BaiA2對(duì)3-oxo-DCA還原的生化分析
通過重新結(jié)合BaiA2與結(jié)合EICs表明3-oxo-DCA通過重組轉(zhuǎn)化為DCA。這個(gè)實(shí)驗(yàn)做過一次。
因此，BaiA2和BaiCD在該途徑中均作用兩次，催化其前兩個(gè)氧化還原步驟和最后兩個(gè)氧化還原步驟。
2 設(shè)計(jì)到C.sporogenes的通路
在確定了該途徑所需和足夠的一組酶之后，我們?cè)噲D獲得對(duì)該途徑的遺傳控制，作為工程腸道菌群膽汁酸輸出的第一步。首先，我們?cè)噲D利用ClosTrongroup II內(nèi)含子系統(tǒng)構(gòu)建本地生產(chǎn)C.scindens的baiCD基因突變;然而，我們沒有成功，因?yàn)槲覀儾荒芡ㄟ^共軛連接引入DNA構(gòu)建到C. scindens上。作為一種替代方法，我們考慮在無法進(jìn)行7 -羥化的腸道共生體中表達(dá)bai通路;然而，值得注意的例外是在Clostridium中轉(zhuǎn)移途徑的方法尚不完善。據(jù)我們所知，沒有一條從一種Clostridium到另一種的途徑還沒有在人類微生物組動(dòng)員的途徑。
我們選擇了C.sporogenesAmerican Type Culture Collection (ATCC)菌株15579作為受體，原因有二:與C. scindens相關(guān)，可能滿足該通路的輔助代謝需求(例如，輔助因子生物生成);基因工具的發(fā)展使質(zhì)粒轉(zhuǎn)化成C. sporogenes。我們最初試圖將8個(gè)基因的全部bai操縱子(baiB baiI)克隆到E. coli–C.sporogenes穿梭載體中，但未能克隆出具有完整操縱子的克隆?？紤]到簇內(nèi)可能存在對(duì)大腸桿菌有毒的基因，我們?cè)诓煌瑔?dòng)子的控制下克隆了簇內(nèi)的不同片段
(詳見補(bǔ)充表2)，最終設(shè)法把集群分為三部分,每一個(gè)在它自己的大腸桿菌c sporogenes穿梭載體:baiB baiF在pMTL83153(pMF01),baiG在pMTL83353(pMF02),baiH–baiI 在pMTL83253 (pMF03) (圖3a 和擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖 7).
圖3 將7α-去羥基化途徑轉(zhuǎn)入C. sporogenes
a,我們將bai操縱子分為三個(gè)質(zhì)粒:pMTL83153中的baiB baiF(質(zhì)粒1，或pMF01)， pMTL83353中的baiG(質(zhì)粒2，或pMF02)和pMTL83253中的baiH baiI(質(zhì)粒3，或pMF03)。我們將pMF01、pMF02和pMF03依次偶聯(lián)到C. sporogenes ATCC15579中，得到MF001。b，結(jié)合EICs顯示，MF001與含有baiG轉(zhuǎn)運(yùn)體的C. sporogenes對(duì)照菌株(MF012)相比，將膽酸轉(zhuǎn)化為DCA。這個(gè)菌株用1μM膽酸培養(yǎng)72 h，丙酮提取，LC-MS檢測，星號(hào)指示為isoDCA。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次，結(jié)果相似。結(jié)合EICs顯示了膽酸由MF001轉(zhuǎn)化為DCA的時(shí)間依賴性。該菌株在1μM膽酸中生長，對(duì)所示時(shí)間點(diǎn)的氨基酸進(jìn)行分析，如b所示。該實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次，結(jié)果相似。d, 頂部，簡化了膽酸的7e -去羥基化生成DCA的途徑，包括本文觀察到關(guān)閉了此途徑水解產(chǎn)物。底部，操縱子單基因缺失的C.sporogenes產(chǎn)生的DCA、途徑中間體和衍生物經(jīng)LC-MS分析離子豐度(如圖左側(cè)所示)。條形圖表示三個(gè)獨(dú)立生物重復(fù)的平均值。e，結(jié)合EICs顯示 C. sporogenes +baiG/baiH將3-oxo-4,5-6,7-didehydro-DCA轉(zhuǎn)化為3-oxo-4,5-dehydro-DCA(左)，C. sporogenes +baiG/baiCD將3-oxo-4,5-dehydro-DCA轉(zhuǎn)化為3-oxo-DCA(右)。每個(gè)菌株都與合成3-oxo-4,5,6,7-didehydro-DCA(左)或3-oxo - 4,5-dehydro-DCA(右)做72 h培養(yǎng)并在b中顯示提取分析的結(jié)果。部分灰痕跡已經(jīng)擴(kuò)大了十倍,讓它更容易想象相對(duì)應(yīng)于3-oxo-DCA和DCA的峰值。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)兩次，結(jié)果相似。
擴(kuò)展圖7 在C. sporogenes中表達(dá)bai操縱子及其部分的|結(jié)構(gòu)
每個(gè)質(zhì)粒都有大腸桿菌和梭狀芽胞桿菌的復(fù)制起點(diǎn)(origin和repH)、使連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的traJ基因和一個(gè)耐抗生素基因(catP、aad9或ermB)。在fdx或spoIIE啟動(dòng)子的控制下，將bai基因?qū)脒@些質(zhì)粒。利用pmtl83153質(zhì)粒進(jìn)行baiCD和baiH功能的遺傳分析。
將pMF01和pMF03中的基因置于C. sporogenes ATCC15579的spoIIE啟動(dòng)子下，該啟動(dòng)子在Clostridium生長后期中表達(dá)，而pMF02中的baiG則由強(qiáng)fdx啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)。我們將這些質(zhì)粒依次連接到C.sporogenes中，得到了MF001菌株。
當(dāng)與膽酸孵育時(shí)，MF001以時(shí)間依賴的方式產(chǎn)生DCA，與僅含有轉(zhuǎn)運(yùn)體(baiG) 的對(duì)照株形成鮮明對(duì)比(圖3b, c)。此外, MF001將CDCA轉(zhuǎn)化為LCA(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6)。
擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖6 體內(nèi)CDCA的7α-去羥基化
結(jié)合EICs顯示，與含有baiG轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(MF012)的C. control菌株(C. controlstrain)相比，帶有三個(gè)質(zhì)粒完整bai蛋白操縱子的C. sporogenes菌株(MF001)可將CDCA轉(zhuǎn)化為LCA。。用1μM膽酸培養(yǎng)72 h;采用高效液相色譜/質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)對(duì)培養(yǎng)上清中的丙酮提取物進(jìn)行了分析。單個(gè)星號(hào)表示isoLCA;用雙星號(hào)表示的峰為isoCDCA。這個(gè)實(shí)驗(yàn)做過一次。
這些數(shù)據(jù)表明，核心bai簇中的8個(gè)基因(圖1)足以將膽汁酸7α-去羥化作用賦予C. sporogenes，盡管它們不排除一個(gè)或多個(gè)內(nèi)源性基因的參與c .sporogenes識(shí)別通路中的分支點(diǎn)。
圖1 結(jié)構(gòu)圖顯示了bai操縱子和7α-去羥基化
a,bai操縱子由8個(gè)基因組成:7個(gè)編碼酶，第8個(gè)baiG編碼轉(zhuǎn)運(yùn)體。它在已知的7種細(xì)菌中保守，且其基因產(chǎn)物已與途徑中的特定步驟相連系。HSDH,hydroxysteroid脫氫酶。b, 膽酸去羥基化生成DCA的簡圖。
為非天然途徑的產(chǎn)物生物合成發(fā)現(xiàn)潛在的非分支點(diǎn),我們構(gòu)造一組八個(gè)基因均被單獨(dú)刪除的菌株(擴(kuò)展數(shù)據(jù)圖7)。我們將這些菌株與膽酸共培養(yǎng)并且分析培養(yǎng)上清液中積聚的中間體(圖3 d)。正如預(yù)期的那樣，該途徑氧化臂基因的缺失導(dǎo)致了早期途徑中間產(chǎn)物的形成。兩個(gè)例外是baiE突變體，只產(chǎn)生cholyl-CoA;而在baif缺失的菌株中，產(chǎn)生了少量的最終產(chǎn)物DCA
未完待續(xù)
