眾所周知，羰基通常不存在于蛋白質(zhì)中的，但當(dāng)在蛋白質(zhì)中引入該基團(tuán)時(shí)，可以讓蛋白質(zhì)獲得額外的反應(yīng)性，這在化學(xué)生物學(xué)中已被證明是廣泛有用的。然而在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生羰基的方法依賴于帶有羰基的非天然氨基酸的共轉(zhuǎn)化摻入或現(xiàn)有天然氨基酸的氧化轉(zhuǎn)化(化學(xué)或酶促)。但是利用蛋白質(zhì)中碳碳鍵直接獲得羰基的方法卻少有報(bào)道，如果可行的話，通過c-c鍵形成羰基化直接添加C=O基團(tuán)的替代策略，將為增加有價(jià)值的反應(yīng)性和擴(kuò)展蛋白質(zhì)中可能的功能提供強(qiáng)有力的方法?；诖?，今日分享來自大不列顛及北愛爾蘭聯(lián)合王國(guó)牛津大學(xué)化學(xué)系Benjamin G. Davis等研究人員的成果Residue-Selective Protein C-Formylation viaSequential Difluoroalkylation-Hydrolysis，該論文發(fā)表在ACS Cent. Sci.上。
首先作者對(duì)最近提出的利用自由基來克服水中碳正離子或碳當(dāng)量不適當(dāng)?shù)膯栴}來合成碳碳的方法進(jìn)行剖析，設(shè)想一種可以直接將蛋白質(zhì)中碳氧鍵演變成羰基的方法。但是，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，該策略過于復(fù)雜，結(jié)合之前工作的發(fā)現(xiàn)，一些天然蛋白殘基會(huì)與CF3?自由基發(fā)生反應(yīng)，而CF3?自由基似乎位于適合某些芳香族蛋白殘基（主要是Trp）的反應(yīng)尖端。但由于天然殘基常是惰性的，對(duì)其他碳自由基而言要求蛋白質(zhì)中存在更多活性(非天然)自由基受體殘基以形成碳碳鍵。但是作者未能直接合成有效的RC（O）?自由基，用于蛋白質(zhì)的直接反應(yīng)（圖2b）。隨后，作者根據(jù)研究其他含蛋白質(zhì)的二氟烷基自由基的過程中發(fā)現(xiàn)可以在溫和的條件下產(chǎn)生HCF2?且其對(duì)天然殘基具有充分的反應(yīng)性，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)通過其固有的化學(xué)選擇性與雜芳族殘基(X = Trp > His，圖2c)加合物中的Reimer-Tiemann水解偶聯(lián)的反應(yīng)性。
所以作者考慮了一種間接的方法，即有效地利用二氟甲基自由基作為掩蓋的“ HC（O）?等效物”，用于蛋白質(zhì)C-甲酰化（圖2c）。所得的非蛋白殘基C-甲酰基-Trp（Cfw）因此在C2處具有最小尺寸的反應(yīng)基團(tuán)。隨后，作者證明了該基團(tuán)可用于蛋白質(zhì)中的選擇性親電子羰基介導(dǎo)的修飾以及用作增強(qiáng)的熒光團(tuán)。
圖2 蛋白質(zhì)C-羰基化的潛在化學(xué)策略分析
接著就是，作者提出一種反向過程(從“CF2”: RCF2→RC(O)或HCF2→HC(O))來獲得RC（O）?或HC（O）?等效物。方法是在水性條件下和有利于水解的電子環(huán)境(例如芐基)中適當(dāng)定位二氟亞甲基前體。雖然CF2部分在飽和位置通常是穩(wěn)定的，但是在(雜)芳烴中芐基或等效位置發(fā)現(xiàn)的鹵代烷基部分可能更容易通過Reimer-Tiemann水解。
作者從測(cè)試合適的二氟烷基RCF2·自由基開始，經(jīng)過系統(tǒng)性的探索測(cè)試，發(fā)現(xiàn)2-吡啶基砜支架（RCF2SO2py1，圖3a）在通常用于蛋白質(zhì)操作和反應(yīng)的水性反應(yīng)緩沖液中顯示出有用的溶解性和良好的穩(wěn)定性。以Ru(bpy)32+為光催化劑，通過光催化還原砜來引發(fā)自由基，對(duì)一系列可能的電子供體中的測(cè)試中發(fā)現(xiàn)，含水緩沖液中的抗壞血酸鈉被證明對(duì)這些反應(yīng)最有效。然而，在細(xì)胞應(yīng)用中，發(fā)現(xiàn)使用非抗壞血酸條件確實(shí)取得了部分成功，這表明某些細(xì)胞存在的內(nèi)源性生物反應(yīng)物也可能代替抗壞血酸發(fā)揮作用。后在模擬典型蛋白質(zhì)修飾方案的條件下（低標(biāo)度/濃度，氨基酸殘基作為限制性底物與過量的其他反應(yīng)物），通過使用15N標(biāo)記標(biāo)準(zhǔn)物的定量LC-MS監(jiān)測(cè)顯示Trp底物具有更高的反應(yīng)活性，并在隨后實(shí)驗(yàn)中證實(shí)，HCF2自由基對(duì)Trp底物具有殘基選擇性的二氟甲基化，產(chǎn)生的C-2-二氟甲基化Trp殘基經(jīng)歷Reimer-Tiemann型脫鹵作用，使蛋白質(zhì)水解折疊成2-甲酰基Trp (Cfw)。
圖3 還原引發(fā)的二氟甲基化作用范圍
然后，作者在確定了模型殘基中由Trp產(chǎn)生Cfw的潛在生產(chǎn)性和選擇性流形之后，我們?cè)陔念惌h(huán)境中測(cè)試這種潛在的反應(yīng)性，即在多肽中進(jìn)行了HC(O)?當(dāng)量的測(cè)試。作者構(gòu)建了兩種短模型多肽底物：一種底物包含代表性的潛在蛋白原性芳香和/或親核殘基，KFWAWH中假定的競(jìng)爭(zhēng)性反應(yīng)位點(diǎn)（Phe，His和Lys以及Trp）以及相應(yīng)的無Trp （Trp→Met，Tyr）發(fā)現(xiàn)“突變體”KFMAYH具有反應(yīng)比較所需的最相似溶解度。為了分析反應(yīng)混合物，作者采用了LC-MS和LC-MS / MS監(jiān)測(cè)，并輔以數(shù)據(jù)依賴采集，以確保通過不斷發(fā)展的中間體和產(chǎn)物的片段化來進(jìn)行無偏分析。隨后驗(yàn)證了從Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的實(shí)用性，開發(fā)了針對(duì)Cfw單殘基設(shè)計(jì)的MS可檢測(cè)化學(xué)衍生方法（見圖4）。
圖4 肽中從Trp到Cfw的二氟烷基化/水解序列的驗(yàn)證。產(chǎn)物的合成TIC-MS光譜對(duì)比分析
在肽系統(tǒng)中證明了所需的反應(yīng)性、位點(diǎn)選擇性和水解Reimer-Tiemann成功能夠使Trp選擇性轉(zhuǎn)化為Cfw后，作者開始研究蛋白質(zhì)底物（圖5）。選擇馬心臟肌紅蛋白，在11個(gè)His、7個(gè)Phe和2個(gè)Tyr殘基中含有兩個(gè)Trp殘基（Trp7和Trp14），因此可作為評(píng)估C-甲酰化序列化學(xué)選擇性的良好試驗(yàn)（二氟甲基化水解，圖5a，左中）。完整的蛋白質(zhì)LC-MS驗(yàn)證產(chǎn)物的成功形成，其質(zhì)量與二氟甲基化相對(duì)應(yīng)，部分是表面水解的物種（圖5a，左圖）。作者利用胰蛋白酶消化評(píng)估反應(yīng)的選擇性，并通過LC-MS/MS分析所得肽。接下來作者測(cè)試了蛋白質(zhì)底物范圍。得到的標(biāo)準(zhǔn)條件可普遍適用于其他具有不同Trp含量（1-6個(gè)殘基）和折疊狀態(tài)（主要是α結(jié)構(gòu)蛋白肌紅蛋白；兩種混合的α/β結(jié)構(gòu)域蛋白溶菌酶和乳清蛋白以及主要的β結(jié)構(gòu)蛋白胰蛋白酶）導(dǎo)致基本相似的良好二氟甲基化水平（全部轉(zhuǎn)化率>60%，圖5b）。最后，對(duì)于肽，在沒有光催化劑或光的情況下，二氟甲基化不進(jìn)行。
圖5 連續(xù)的二氟烷基化水解可以獲得蛋白質(zhì)中的Cfw
隨后，作者在蛋白質(zhì)中對(duì)其化學(xué)選擇性和熒光光譜進(jìn)行了探究。將Cfw作為一種新的殘基安裝到潛在的反應(yīng)位點(diǎn)中，增加了通過醛化甲?；鶎?shí)現(xiàn)多種親電“捕獲”模式的可能性，這種模式可以補(bǔ)充和擴(kuò)展其他反應(yīng)模式。通過氘化物添加（使用NaBD4），Cfw在蛋白質(zhì)中的明顯和清晰的反應(yīng)性已經(jīng)得到證實(shí)，其效率大于90%。并對(duì)廣泛有效使用的α-親核試劑進(jìn)行了測(cè)試，發(fā)現(xiàn)Cfw顯示出明顯的強(qiáng)固有反應(yīng)性，并且只有在少數(shù)情況下需要連接催化劑。以這種方式，攜帶Cfw的蛋白質(zhì)可以容易地用適合于19F NMR的19F標(biāo)記物（圖5c）進(jìn)行標(biāo)記。同時(shí)，還測(cè)試了Cfw中醛反應(yīng)的第三種模式。含eqMyo的Cfw與一系列苯胺和烷基胺進(jìn)行了現(xiàn)成的還原胺化反應(yīng)，使用NaBH3CN作為二氟甲基化水解標(biāo)記序列的一部分，使Cfw的轉(zhuǎn)化率達(dá)到未優(yōu)化的85%。
為了直接在含Cfw的蛋白質(zhì)中檢測(cè)這種紅移的自體熒光，作者使用寬范圍的紫外光透照（λmax=302nm），在高于天然Trp熒光發(fā)射波長(zhǎng)（>480nm）的波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)。只有含有Cfw的樣品顯示出光發(fā)射（圖5d）。
最后，作者測(cè)試了在細(xì)胞環(huán)境中的應(yīng)用（圖6）。采用熒光相關(guān)細(xì)胞分選（FACS）分析來鑒定那些在Cfw形成的發(fā)射頻率下具有增強(qiáng)熒光的細(xì)胞（～450 nm）。應(yīng)用于人類T淋巴細(xì)胞（Jurkat）細(xì)胞的二氟甲基化/水解反應(yīng)允許在二氟甲基化反應(yīng)時(shí)間過程（<90 s）下鑒定條件，該時(shí)間過程允許在隨后的水解處理后在活細(xì)胞中顯著誘導(dǎo)熒光（見圖6a）。雖然延長(zhǎng)二氟甲基化反應(yīng)時(shí)間導(dǎo)致細(xì)胞相關(guān)熒光增加，但也導(dǎo)致細(xì)胞活力降低。此外，與Cfw形成一致，在更高溫度下對(duì)反應(yīng)的“甲酰化”細(xì)胞進(jìn)行水解處理后，觀察到相關(guān)的熒光水平增加（見圖6b），類似于在體外對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行的觀察。
圖6 白血病人T淋巴細(xì)胞（Jurkat）細(xì)胞的二氟甲基化/水解和熒光活化分選
所以，作者通過開發(fā)在抗壞血酸鹽存在下的還原性光催化蛋白質(zhì)修飾可以有效地產(chǎn)生HCF2自由基，從而產(chǎn)生對(duì)Trp具有殘基選擇性的二氟甲基化；產(chǎn)生的C-2-二氟甲基化Trp殘基經(jīng)歷Reimer-Tiemann型脫鹵作用，使蛋白質(zhì)水解折疊成2-甲酰基Trp (Cfw)。這種自由基加成-水解方案現(xiàn)在允許對(duì)蛋白質(zhì)中的醛進(jìn)行直接規(guī)?；幕瘜W(xué)處理，允許其在已建立的醛標(biāo)記和連接化學(xué)(腙連接、肟連接、還原性胺化、還原性氘化)中快速開發(fā)，同時(shí)具有新的位點(diǎn)(Trp)選擇性。
【文章鏈接】https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c01193
【D O I】https://dx.doi.org/10.1021/acscentsci.0c01193
