DOI: https://doi.org/10.1021/acscentsci.1c00117拉曼散射現(xiàn)象從發(fā)現(xiàn)至今已有百年歷史。它是無(wú)機(jī)晶體或有機(jī)分子的窄帶振動(dòng)光譜，可從分子層面揭示豐富的結(jié)構(gòu)信息。科學(xué)家雖然被拉曼散射的這種魅力吸引，卻一直受制于一個(gè)問(wèn)題——拉曼散射截面小、靈敏度低。圍繞這個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題，研究者們?cè)趯で蠼鉀Q方案的路上，開創(chuàng)了許多不可思議的研究方向，例如表面增強(qiáng)拉曼散射（SERS）、反斯托克斯拉曼散射（CARS）、受激拉曼散射（SRS）和針尖增強(qiáng)拉曼散射（TERS）。上述基于外部環(huán)境調(diào)控的增強(qiáng)策略（extrinsic enhancing methodology），巧妙而有效的提升了拉曼信號(hào)的靈敏度（可達(dá)單分子水平）。然而，在實(shí)際應(yīng)用中，這些方法面臨各自的挑戰(zhàn)：可控制備表面等離基元材料具有一定難度，這限制了拉曼定量表征的重現(xiàn)性與準(zhǔn)確性；非線性光學(xué)儀器需要昂貴的可調(diào)激光與復(fù)雜的光學(xué)設(shè)置，使其無(wú)法被研究者廣泛使用。因此，大家渴望發(fā)現(xiàn)一種基于分子自身結(jié)構(gòu)的拉曼增強(qiáng)新原理、新方法，能夠?qū)瘜W(xué)鍵振動(dòng)的拉曼信號(hào)點(diǎn)石成金。假如這種普適性增強(qiáng)模塊能與SERS、CARS、SRS或TERS兼容，將聯(lián)合分子自身結(jié)構(gòu)與外部環(huán)境兩方面，共同解決拉曼散射截面小的核心問(wèn)題。如果擁有了這樣的解決方案，拉曼光譜與成像這位故事主角，將更加自由地發(fā)揮其魅力——借助分子振動(dòng)的指紋信息，深入探索復(fù)雜體系的未知反應(yīng)機(jī)理。 ▲圖1. 偶氮增強(qiáng)拉曼散射的原理示意圖。
近期，華中師范大學(xué)高婷娟教授研究小組，報(bào)道了一種分子內(nèi)拉曼增強(qiáng)新方法——偶氮增強(qiáng)拉曼散射(Azo-enhanced Raman Scattering, AERS)。這種方法共軛連接偶氮苯與振動(dòng)基團(tuán)，增加電子能級(jí)與振動(dòng)能級(jí)的耦合程度，紅移分子吸收峰至可見區(qū)，實(shí)現(xiàn)共振拉曼效應(yīng)，大幅提高拉曼散射強(qiáng)度。同時(shí)，偶氮苯順?lè)串悩?gòu)化導(dǎo)致非輻射能量釋放，抑制熒光背景，進(jìn)一步提高拉曼散射的信噪比。基于這種新原理，作者合成了苯環(huán)取代的多炔、多烯與硝基苯、偶氮苯、苯乙腈、苯乙炔等一系列AERS分子，其中心基團(tuán)的振動(dòng)模式分別為ν (C≡C), ν (C=C), ν (O?N=O), ν (CPh?N), ν (C≡N)和ν (C≡CH)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，偶氮增強(qiáng)拉曼散射具有普適性：對(duì)于各類中心基團(tuán)的化學(xué)鍵振動(dòng)，偶氮苯作為增強(qiáng)模塊，可以提高拉曼特征峰信號(hào)2~3個(gè)數(shù)量級(jí)。其中，Azo-3的RIE值高達(dá)2.8×104（RIE：相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)分子5-乙炔基-2’脫氧尿嘧啶核苷EdU的拉曼信號(hào)強(qiáng)度）。它的吸收、熒光與拉曼光譜清晰驗(yàn)證了偶氮增強(qiáng)拉曼散射效應(yīng)。此外，由于中心基團(tuán)的振動(dòng)模式?jīng)Q定了拉曼特征峰頻率（涵蓋指紋區(qū)與基頻區(qū)1000-2500 cm-1），選擇不同AERS分子進(jìn)行組合式拉曼標(biāo)記，可以提供多色檢測(cè)或多色成像功能。▲圖2. AERS分子不同振動(dòng)模式的振動(dòng)頻率與偶氮增強(qiáng)拉曼散射強(qiáng)度。
▲圖3. AERS分子Azo-3的吸收、熒光與拉曼光譜性質(zhì)。
作者采用細(xì)胞高靈敏拉曼多色成像的實(shí)例，演示了AERS的應(yīng)用場(chǎng)景。以細(xì)胞線粒體靶向探針為例，作者篩選了大量AERS分子，得到了線粒體的六色AERS探針。它們具有良好的水酯兩親性、細(xì)胞穿透性、光穩(wěn)定性與較低的細(xì)胞毒性。探針靶向線粒體后，作者使用常規(guī)拉曼共聚焦顯微鏡，mapping后得到清晰的細(xì)胞AERS成像，成像質(zhì)量與熒光成像相當(dāng)。這是截至目前為止最高質(zhì)量的基于小分子拉曼探針的自發(fā)拉曼散射細(xì)胞成像。此外，AERS多色標(biāo)記的混合細(xì)胞解碼實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步拓展了應(yīng)用場(chǎng)景：作者結(jié)合拉曼光譜的指紋信息讀取，可以準(zhǔn)確識(shí)別混合細(xì)胞中每個(gè)細(xì)胞對(duì)應(yīng)的特征ID。由于AERS多色成像與多色編碼可用于復(fù)雜混合體系中多個(gè)對(duì)象的同時(shí)觀測(cè)，這項(xiàng)技術(shù)將為深入研究細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞間相互作用，提供新穎、有效的研究工具。▲圖4. Hela細(xì)胞的AERS多色成像。
▲圖5. 混合AERS編碼細(xì)胞的多色成像。
這項(xiàng)工作通過(guò)系統(tǒng)性研究，提出了偶氮增強(qiáng)拉曼散射新方法，并指出：實(shí)現(xiàn)這種方法最重要的條件，是偶氮苯與中心基團(tuán)的共軛連接。滿足此項(xiàng)條件后，分子產(chǎn)生光吸收，中心基團(tuán)化學(xué)鍵的電子激發(fā)態(tài)與分子振動(dòng)發(fā)生能量共振，激發(fā)光的電磁場(chǎng)被高效利用，拉曼散射強(qiáng)度大幅提升。同時(shí)，偶氮苯的順?lè)串悩?gòu)化，抑制電子從激發(fā)態(tài)躍遷至基態(tài)，避免光吸收的能量轉(zhuǎn)化為熒光，熒光背景大幅降低?；谏鲜鰞煞矫鏅C(jī)理，偶氮增強(qiáng)拉曼散射可增強(qiáng)信號(hào)2-3個(gè)數(shù)量級(jí)。這種新方法、新原理，將為拉曼光譜與成像開拓更廣闊的應(yīng)用前景：分子層面的指紋與結(jié)構(gòu)信息，會(huì)更加清晰的展現(xiàn)在我們面前，從而為探索復(fù)雜體系未知反應(yīng)機(jī)理提供更有力的證據(jù)。此項(xiàng)研究的通訊作者是華中師范大學(xué)的唐浴塵和高婷娟教授，主要實(shí)驗(yàn)由碩士研究生莊永鵬完成。Yuchen Tang,* Yongpeng Zhuang, Shaohua Zhang, Zachary J. Smith, Yuee Li, Xijiao Mu, Mengna Li, Caili He, Xingxing Zheng, Fangfang Pan, Tingjuan Gao,* Lizhi Zhang, Azo-enhanced Raman Scattering for Enhancing the Sensitivity and Tuning the Frequency of Molecular Vibrations. ACS Central Science, 2021, DOI: 10.1021/acscentsci.1c00117.https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acscentsci.1c00117
