了解底物處理過程對設(shè)計聚酮合酶（PKS）產(chǎn)生新的代謝物很重要，而TE-domain（硫酯酶）是設(shè)計PKS系統(tǒng)中的一個重要瓶頸。本文探究了PKS模塊中TE-domain的替換如何影響其處理天然和非天然底物的能力。研究人員通過結(jié)構(gòu)域互換構(gòu)建了一系列帶有異源TE-domain的雜合PKS，其能有效處理非天然底物，并實現(xiàn)了產(chǎn)物多樣化。本研究表明TE-domain可以作為蛋白質(zhì)工程的目標(biāo)，以促進(jìn)產(chǎn)生聚酮天然產(chǎn)物類似物。
TE結(jié)構(gòu)域是非天然底物合成中的主要催化區(qū)域，而含有與異源底物匹配的TE結(jié)構(gòu)域的工程化PKS模塊通?？梢曰謴?fù)聚酮化合物的合成。本文中，最初的實驗試圖使用來自苦霉素（Pik）和紅霉素（DEBS）系統(tǒng)的兩個模塊和來自juvenimicin（Juv）途徑的倒數(shù)第二個模塊，將全長聚酮中間體（1-3，Figure 1a）轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的macrolactones（4-8）。這些模塊共享相似的結(jié)構(gòu)域架構(gòu)和將優(yōu)化的聚酮底物轉(zhuǎn)化為macrolactone類天然產(chǎn)物的能力（4、6、9-10，Figure 1b）。值得注意的是，PKS模塊中酮還原酶（KR）結(jié)構(gòu)域的存在與否會影響最終的macrolactones是否包含3-羥基（4，7）或3-酮（5，6）官能團(tuán)。
Figure 1a. Reaction schemeof PKS modules processing their native full-length synthetic substrates 14a,24b, 34c to the corresponding macrolactones.
野生型PKS模塊（Figure 1a）在體外可以有效地將天然底物加工成相應(yīng)的macrolactones，而對非天然底物的利用率較低。與之前的報道一致，Pik Mod6-Pik TE可有效地將2轉(zhuǎn)化為narbonolide（6）。雖然DEBS Mod6-DEBS TE產(chǎn)生了大量的3-hydroxy-narbonolide（7），但其他非天然反應(yīng)中都不能從2產(chǎn)生明顯可檢測的6或7。最近，已經(jīng)證明TE修飾對PKS處理非天然底物有顯著影響。由此推斷，含有非天然底物的反應(yīng)的產(chǎn)率下降（Figure 1c），至少部分是由于TE結(jié)構(gòu)域的無效催化造成的。
Figure 1. (b) Domainarchitecture of the PKS modules used in this study and the native macrolactone products fromeach respective biosynthetic pathway. (c) Table of percent conversion forreactions with substrates 1-3.
為了確定產(chǎn)量下降是否源于每個末端模塊中聚酮中間體和TE結(jié)構(gòu)域之間的相容性問題，研究人員設(shè)計獲得了一系列PKS融合蛋白，將天然的TE結(jié)構(gòu)域替換到異源系統(tǒng)中的相應(yīng)結(jié)構(gòu)域。模塊選自功能相關(guān)的Pik、DEBS和Juv生物合成PKS（Figure 1b）。研究者使用1作為底物來測試雜合TE模塊的靈活性，且所有雜合模塊共享相同的結(jié)構(gòu)域（KS-AT-KR-ACP-TE）。結(jié)果表明，當(dāng)下游的Pik TE與引入的非天然中間產(chǎn)物（1）正確匹配時，這些PKS模塊的KS-AT-ACP-KR結(jié)構(gòu)域保持了適當(dāng)?shù)拇呋δ埽患词沟孜铮?/span>1）是PKS模塊（Pik Mod5）的天然底物，DEBS和Juv 的TE結(jié)構(gòu)域也不能有效地產(chǎn)生12元環(huán)macrolactone；TE結(jié)構(gòu)域與天然聚酮底物配對顯著提高了產(chǎn)物產(chǎn)量。因此，選擇或修改模塊內(nèi)的TE可以增加產(chǎn)物產(chǎn)量和實現(xiàn)對非天然底物的加工（Table 1）。
Table 1. Evaluation of PKSTE hybrid modules with 1, the native substrate of Pik Mod5.
接下來，研究人員探究了雜合TE模塊接受和轉(zhuǎn)化六酮（2）為14元環(huán)macrolactones的能力（Table 2）。與使用1的結(jié)果類似，用DEBS或Juv TE結(jié)構(gòu)域替換Pik Mod6中的同源Pik TE結(jié)構(gòu)域?qū)е?/span>Pik Mod6將2轉(zhuǎn)化為6的能力嚴(yán)重降低。然而，當(dāng)與DEBS Mod6反應(yīng)時，2可轉(zhuǎn)化為6和7?；衔?/span>7由DEBS和Juv TE融合蛋白產(chǎn)生，但與Pik TE反應(yīng)時，有利于產(chǎn)生6。這一結(jié)果表明，當(dāng)釋放14元環(huán)時，各種TE結(jié)構(gòu)域在C-3位置的功能與其固有的鏈延長中間產(chǎn)物相匹配。
Table 2. Evaluation of PKSTE hybrid modules with 2.
這些數(shù)據(jù)表明，TE結(jié)構(gòu)域有效地環(huán)化高級聚酮中間體的能力取決于線性聚酮鏈中存在的官能團(tuán)（Figure 2）。Pik Mod6的天然線性seco acid在C-3位是不還原的，它的同源TE顯示出對這種ACP結(jié)合底物的偏好性。令人驚訝的是，當(dāng)作為DEBS Mod6-Pik TE雜合體被替換到DEBS Mod6上時，Pik TE保持了其對3-酮基ACP鏈中間體的偏好，并選擇性地催化環(huán)化到6。這一結(jié)果表明，未還原的ACP鏈中間體與非同源Pik TE的結(jié)合親和力比與其自身天然KR結(jié)構(gòu)域的結(jié)合親和力更高。Pik TE與C-3酮中間體強烈相互作用的能力也可在1與DEBS Mod6-Pik TE反應(yīng)產(chǎn)生5的反應(yīng)中觀察到。
Figure 2. Biocatalytic mechanism of the processing of 2 by DEBS Mod6.
研究者測試了雜合TEs與上游模塊結(jié)合時保持活性的能力，這一相互作用對后期PKS改造至關(guān)重要，因為它確保了雜合蛋白在其他模塊背景中正確發(fā)揮作用。使用3與Juv Mod6進(jìn)行反應(yīng)，Juv Mod6必須將延長的中間產(chǎn)物傳遞給Juv Mod7-TE進(jìn)行額外的延伸和環(huán)化（Table 3）。結(jié)果表明，當(dāng)與Juv Mod7融合時，DEBS、Juv和Pik TE結(jié)構(gòu)域都具有生成16元環(huán)macrolactones的能力。對丁內(nèi)酯（9）進(jìn)行定量，發(fā)現(xiàn)Juv Mod6+Juv Mod7-Juv TE的效率最高（34%），接著是Juv Mod7-DEBS TE（30%）。這一結(jié)果不僅表明PKS混合TE模塊在與上游模塊一起使用時具有催化活性，而且還進(jìn)一步支持了TE對3-羥基或3-酮官能團(tuán)的選擇性。
Table 3. Reaction of 3 withJuv Mod6 + Juv Mod7 TE hybrids.
在確定了TE結(jié)構(gòu)域在工程化PKS系統(tǒng)中的關(guān)鍵作用后，嘗試?yán)没旌?/span>TE模塊來生產(chǎn)非天然macrolactones。因此，利用雜合Juv Mod6 TE與底物3進(jìn)行篩選，以探索產(chǎn)生預(yù)測的8的能力（Scheme 1），結(jié)果卻產(chǎn)生了含有seco acid的吡喃13，其與8質(zhì)量相同。這些結(jié)果表明，延伸的六酮很可能是作為seco acid從PKS模塊中卸載出來的，它在半縮酮和seco acid之間快速相互轉(zhuǎn)化，隨后脫水生成最終的產(chǎn)物13。
Scheme 1. Reaction of JuvMod6-Pik TE with Tyl hexaketide 3 results in pyran 13, which is identical in mass to macrolactone 8.
綜上，本文步深入了解了I型模塊化PKS TE結(jié)構(gòu)域的底物靈活性及其在PKS設(shè)計中的應(yīng)用。TE結(jié)構(gòu)域是將非天然底物轉(zhuǎn)化為macrolactones和其他分子的關(guān)鍵催化結(jié)構(gòu)域。同時， TE結(jié)構(gòu)域的同一性也可能改變工程PKS模塊中發(fā)生的催化事件的順序。通過探索非天然TE結(jié)構(gòu)域如何通過組合生物合成和定向途徑工程化策略減少產(chǎn)物的形成，研究者將能夠更有效地設(shè)計細(xì)菌I型PKS途徑，以促進(jìn)產(chǎn)生聚酮天然產(chǎn)物類似物。
