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熒光探針信號(hào)的選擇性激活是一種探究生物過(guò)程的有效方法。該類(lèi)探針通常是基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)等相關(guān)機(jī)理的多生色團(tuán)系統(tǒng)。另一種方法則是利用熒光探針的生色團(tuán)自身發(fā)生化學(xué)轉(zhuǎn)化從而引起信號(hào)變化?；谙愣顾?、羅丹明和花菁骨架的衍生物是幾種重要且常見(jiàn)的熒光探針，如吲哚菁綠(ICG)和IR-800CW等七甲川花菁已廣泛應(yīng)用于醫(yī)療診斷。

近期，美國(guó)國(guó)家癌癥研究所的Martin J. Schnermann博士在《J. Am. Chem. Soc.》 期刊上發(fā)表了題為“Norcyanine-Carbamates Are Versatile Near-Infrared Fluorogenic Probes”的研究論文。文中，作者開(kāi)發(fā)了響應(yīng)型花菁氨基甲酸酯探針，該探針是基于七甲川花菁與氨基甲酸芐酯反應(yīng)生成的。其中，谷氨酸取代的CyBam-γ-Glu以高選擇性被卵巢癌標(biāo)志物γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)激活。這一類(lèi)新型的多功能NIR熒光探針，具有在體內(nèi)應(yīng)用的巨大潛力。

圖1. (a) 常用的NIR響應(yīng)型熒光探針設(shè)計(jì)。i) 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的供受體對(duì)，ii) 自猝滅。 (b) 本文開(kāi)發(fā)的基于磺化七甲川花菁與氨基甲酸芐酯反應(yīng)形成穩(wěn)定的CyBam探針。

方案1：NorCy7和4-硝基苯基碳酸酯在NaH和DMF中生成相應(yīng)的花菁氨基甲酸酯CyBam-N₃。

圖2：(a) CyBam-N₃的熒光開(kāi)啟有兩步：(i) 氨基甲酸酯基團(tuán)的裂解；(ii) 吲哚質(zhì)子化。 (b) CyBam-N_3、NorCy7和CYPam7-[H ⁺ ]的吸收光譜。 (c) pH=7.4的PBS中NorCy7-[H⁺]以及pH=5.2的 PBS中CyBam-N₃和NorCy7的圖像。 (d) PPh₃存在時(shí)，60分鐘內(nèi)完成了向NorCy7-[H⁺]的完全轉(zhuǎn)化。 (e) CyBam-N₃轉(zhuǎn)化為NorCy7-[H⁺]時(shí)熒光信號(hào)增強(qiáng)了170倍。

圖3：(a) CyBam-γ-Glu和CyBam-NC的結(jié)構(gòu)。(b) 隨著與CyBam-γ-Glu (20μM)孵育的γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)濃度的升高(0-400 U/L)，熒光強(qiáng)度逐漸增加。 (c) 37°C時(shí)，CyBam-γ-Glu分別與GGT (100 U/L)，亮氨酸氨基肽酶(LAP，800 U/L)和豬肝酯酶(PLE，800 U/L) 在pH=7.4的PBS孵育中30分鐘，再將溶液pH調(diào)整至5.2后放置30分鐘。組織蛋白酶B (CatB，2.5μg)在37°C、pH=5.2的醋酸鹽緩沖液中使用。結(jié)果表明，CyBam-γ-Glu被GGT特異性激活。(d) CyBam-γ-Glu (20μM)和CyBam-NC (20μM) 在SHIN-3細(xì)胞中共聚焦成像。探針和Hoechst的熒光信號(hào)分別為紅色和藍(lán)色。用CyBam-γ-Glu處理的細(xì)胞中觀察到明顯的熒光信號(hào)。 (e) SHIN-3細(xì)胞中加入GGT抑制劑(DON，GGsTop)的流式結(jié)果。加入CyBam-NC或GGT抑制劑的細(xì)胞中觀察到較弱的熒光信號(hào)。 (f) 向SHIN-3-ZsGreen轉(zhuǎn)移性腫瘤模型中注射CyBam-γ-Glu (30 nmol)，1、3和6小時(shí)后對(duì)原發(fā)性腫瘤和局部轉(zhuǎn)移瘤進(jìn)行成像。CyBam-γ-Glu和ZsGreen信號(hào)之間的共定位表明該探針被腫瘤細(xì)胞選擇性激活。