今天分享一篇發(fā)表在Nature Communications上的文章。通訊作者是來自中國科學院上海藥物研究所的陳小華教授。他們組主要關注蛋白質間相互作用和靶標確證研究、基于靶向蛋白降解技術的創(chuàng)新藥物研發(fā)。
生物正交的點擊反應是目前最強大的分子組裝策略之一，其中光驅動的photoclick反應避免了有毒金屬催化劑和配體的使用，同時能夠提供較高的時空分辨率。目前的photoclick反應數(shù)量仍然較少，開發(fā)新型的photoclick反應是極有必要的。本文作者開發(fā)了一種由光激活的伯胺和鄰硝基芐醇（o-NBAs）環(huán)化反應（簡稱為PANAC），能夠在體外和生物體系中實現(xiàn)小分子和生物分子的快速功能化。
在本文之前，已經有多個組證明了o-NBA和伯胺之間由光催化的反應；而作者此前也成功讓o-NBAK這種非天然氨基酸實現(xiàn)其和臨近的賴氨酸ε-氨基形成吲哚酮來在活細胞中捕捉相互作用。這些依賴于不同催化條件及反應物濃度的實驗結果使作者嘗試優(yōu)化光激活PANAC使其成為photoclick反應。在篩選之后，他們發(fā)現(xiàn)帶有吸電子酰胺基團的o-NBA骨架和伯胺有高反應性，并進一步優(yōu)化了反應體系和誘導條件。在化學反應上，他們證明了o-NBA能夠在較低的伯胺當量（2μM）下、在中-堿性緩沖環(huán)境中、通過幾分鐘的光照進行高效的photoclick反應，其產物也能夠穩(wěn)定存在。他們進一步評價了一系列的含伯胺分子與o-NBAs的PANAC反應。整體上，PANAC反應的產率都較高，能夠和各種藥物小分子、Biotin、熒光染料和疊氮化物適配，同時能夠完成PROTAC的組裝。
接下來，作者們進行了PANAC的應用。首先，在肽水平上，他們能夠利用o-NBAs將Biotin、疊氮或者炔基引入到Lys的氨基上；在同時含有Cys/Tyr和Lys的肽上，讓o-NBA依次和Cys/Tyr及未保護的Lys反應從而實現(xiàn)了肽環(huán)化。之后，他們在包括nanobody-HER2在內的多種單蛋白抗體上，通過PANAC在Lys上引入炔基，并通過CuAAC反應帶上熒光，證明了兩種Click反應間的兼容性；而被修飾的HER2抗體能夠正常發(fā)揮功能，在活細胞上結合靶標并通過修飾的熒光進行成像。
接著，他們在活細胞上進行了實驗，來驗證PANAC的生物相容性。他們設計了嘧啶3-氨基吡唑支架上的o-NBA探針，支架可通過氫鍵結合激酶、o-NBA區(qū)則能夠在光照后和ATP結合區(qū)的保守賴氨酸反應。使用探針，他們成功捕捉到了Jurkat細胞系中91種激酶、K562細胞系中76中激酶，比最近無殘基特異性的光反應性的Diazirine泛激酶探針鑒定到更多。這些結果表明了PANAC反應的生物兼容性，并提供了一種在活細胞中進行激酶譜分析的方式。最后，他們還測試了利用PANAC反應標記細胞器的能力。使用靶向線粒體的Rho-o-NBA熒光探針孵育細胞，發(fā)現(xiàn)只有光激活時熒光才會特異性出現(xiàn)在線粒體上；結合被修飾的HER2納米抗體在活細胞上的標記結果，這些共同說明了PANAC反應在實現(xiàn)生物分子時間、空間特異性的標記及調控上的潛能。
綜上，本文發(fā)展了新型的photoclick反應PANAC，通過光激活o-NBA和伯胺的環(huán)化。這種反應有很好的產率、生物兼容性以及時空可控性，為小分子功能化以及生物分子的標記提供了新的工具。
本文作者：MYZ
原文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-19274-y
原文引用：DOI：https://doi.org/10.1038/s41467-020-19274-y
責任編輯：LBW
