今天和大家分享一篇發(fā)表在Angew. Chem. Int. Ed上的文章，題目是“Secondary Amino Alcohols: Traceless Cleavable Linkers for Use inAffinity Capture and Release”，通訊作者是麻省理工學(xué)院化學(xué)系B.L.Pentelute教授
背景介紹
肽的捕獲和釋放是發(fā)現(xiàn)具有新功能物質(zhì)的關(guān)鍵步驟。然而，一般來講，有效捕獲的最佳方法同時(shí)會(huì)阻礙肽的輕松釋放。目前廣泛采用的鏈霉親和素-生物素親和捕獲和釋放受到了這種限制（圖1a）。為了釋放生物素捕獲的肽，需要變性條件（例如在十二烷基硫酸鈉（SDS）緩沖液中煮沸），這可能導(dǎo)致多肽降解和污染。因此，需要一種新的方法來有效地回收鏈霉親和素捕獲的多肽。
可切割linkers是一種很有吸引力的工具，可以在親和捕獲后釋放多肽。linkers由化學(xué)小分子組成，這些化學(xué)小分子可以1）并入肽中，2）在特定條件下裂解。
基于鄰二醇的linkers適合標(biāo)準(zhǔn)的固相肽合成（SPPS）操作（Scheme 1b）。1,2-二醇在堿性和酸性條件下穩(wěn)定，用高碘酸鈉可以裂解。這些氧化條件不會(huì)破壞折疊蛋白和細(xì)胞。
Figure 1
氨基醇被高碘酸鈉裂解的速度比二醇快1000倍。本文報(bào)道了一種基于這種結(jié)構(gòu)的SPPS兼容linker。然而，這種linker需要九步合成，因此對(duì)其廣泛適用性提出了挑戰(zhàn)。
本文作者報(bào)道了將仲氨基醇作為一類新的可氧化裂解的Linker。在小分子研究中，仲氨基醇對(duì)NaIO4的氧化反應(yīng)活性與伯氨基醇相同。
作者基于絲氨酸（seramox）和異絲氨酸（isoseramox）設(shè)計(jì)了兩個(gè)linker。在SPPS過程中，這兩個(gè)Linker可以通過還原胺化插入到肽主鏈中。兩個(gè)Linker在數(shù)分鐘內(nèi)可被高碘酸鹽定量快速裂解（Scheme 1c）。
Scheme 1
異絲氨酸Linker在裂解時(shí)釋放出一個(gè)N端游離的多肽，這是第一個(gè)無痕高碘酸鹽可切割Linker的例子。異絲氨酸Linker被引入到一個(gè)216個(gè)成員的肽庫中，顯示出對(duì)合成和裂解的廣泛的底物耐受性。異絲氨酸Linker也與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)條件兼容。在高碘酸鹽捕獲并選擇性釋放前，一種含有異絲氨酸的細(xì)胞穿透肽可以進(jìn)入細(xì)胞胞漿。因此，二級(jí)氨基醇Linker使需要捕獲和釋放合成肽成為可能。
結(jié)果與討論
在固相合成過程中，仲氨基醇可以被引入肽鏈中。（Scheme 1a）。二級(jí)氨基醇結(jié)構(gòu)與Gly-Ser二肽類似，Gly-Ser其中一個(gè)羰基被亞甲基取代，這種官能團(tuán)被認(rèn)為是酰胺的生物電子等排體。含絲氨酸Linker的肽在5分鐘內(nèi)被定量裂解，這比相應(yīng)的含二醇的肽要快（圖2）。在相同裂解條件下，二醇4a在60分鐘后不到30% 被裂解。而含有絲氨酸Linker的多肽4b的血清在5分鐘后被裂解為完全轉(zhuǎn)化。
含seramox結(jié)構(gòu)的多肽裂解產(chǎn)生N-末端為醛的多肽產(chǎn)物（Scheme 1b）。然而，醛類化合物會(huì)抑制MS信號(hào)，特別是阻礙MS/MS測序。這個(gè)問題不僅存在于seramox，也存在于已知的二醇和氨基醇連接物。
而基于異絲氨酸的二級(jí)氨基醇Linker（isoseramox）使N-末端游離多肽的無跡釋放成為可能。用高碘酸鹽裂解isoseramox得到N端為胺的多肽而不是醛類，克服了已知Linker的質(zhì)譜測序挑戰(zhàn)。此外，由于含isoseramox的多肽更易于釋放，應(yīng)用將會(huì)更廣泛。
用固相合成方法將Isoseramox連接體整合到肽中。異絲氨酸衍生醛（8）分三步合成。肽9（LAGV）上的還原胺化獲得含Isoseramox的肽4c（Scheme2b）。NaIO4在5min內(nèi)將含有Isoseramox-的肽4c的定量轉(zhuǎn)化為N端游離的肽5c（圖2）。盡管從一級(jí)醇（seramox）變?yōu)橐患?jí)位阻二級(jí)醇（Isoseramox），反應(yīng)時(shí)間不受影響。
Scheme 2
isoseramox具有廣泛的底物耐受性。作者將isoseramox整合到一個(gè)組合肽庫中來測試1）它對(duì)幾個(gè)N-末端殘基的添加效率和2）對(duì)不同氨基酸側(cè)鏈氧化裂解的耐受性。作者合成了216個(gè)成員的組合肽庫。
肽庫包含17個(gè)典型氨基酸，分布在8個(gè)位置（1234LAYK），其中4個(gè)位置可變（圖3）。位置1可以是Asp、Met、His、Trp、Tyr、Val、Lys或Gln（包含堿性、酸性、酰胺基、芳香族和脂肪族殘基）；位置2可以是Ser、Ala或Leu；位置3可以是Glu、Asn或Gly，位置4可以是Phe、Pro和Thr。
Figure 3
肽庫被分為兩個(gè)部分：第一部分裂解后作為參考肽庫library A。第二部分用isoseramox烷基化，然后生物素化（library B）。將肽庫B固定在磁性鏈霉親和素微球上，用微固相萃取法對(duì)肽庫B進(jìn)行脫鹽，并在光譜儀上進(jìn)行納米LC-MS/MS分析。使用測序軟件PEAKS 8.5分析MS/MS光譜，并對(duì)獲得的完整序列列表進(jìn)行額外過濾，以獲得符合庫設(shè)計(jì)的肽（正確的長度和位置1、2、3和4處的正確單體）。
實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從參考庫a和肽庫B鑒定的序列幾乎相同：分別鑒定出90%（216個(gè)中的194個(gè)）和94%（216個(gè)中的2024個(gè)）。所有8個(gè)可能殘基都在1位的序列被鑒定出來。這證明了isoseramox的合成和裂解是有效的。
在研究了短肽條件下的（iso）seramox后，作者用SPPS法合成了Z33蛋白（Z33含有一個(gè)33個(gè)氨基酸的a螺旋），用圓二色譜法（CD）證實(shí)了Z33的α-螺旋結(jié)構(gòu)。用4mM高碘酸鈉處理Z33（即比最苛刻的裂解條件濃縮4倍）30分鐘后，CD光譜沒有顯示任何變化。這一結(jié)果表明，高碘酸鹽處理不會(huì)破壞a螺旋結(jié)構(gòu)。
用鏈霉親和素捕獲生物素化肽后，目前很難將肽釋放出來進(jìn)行分析。比較常用的破壞生物素-鏈霉親和素相互作用的方法是在含有SDS的緩沖液中加熱復(fù)合物。作者將此策略與基于（iso）seramox的肽釋放工作進(jìn)行了比較。制備了兩組肽，10a-c和12a-c。其中10a-c肽的C端含有 seramox-Lys (biotin)，12a-c肽的C端含有（Gly-Ser-Lys(biotin)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，基于(Iso）seramoxd策略的從鏈霉親和素珠中釋放生物素化肽比SDS變性策略更有效（圖4）。
Figure 4
Isoseramoxlinker也與細(xì)胞的分析條件兼容。在篩選與整個(gè)細(xì)胞結(jié)合的肽或細(xì)胞穿透肽（CPPs）時(shí)，通常需要從細(xì)胞中釋放命中的肽。在這里，作者證實(shí)了isoseramox Linker可以用來從HeLa細(xì)胞中回收CPP。
作者合成了已知的CPP D-穿膜肽的變體（13，圖5a）。含isoseramox的CPP保持了其細(xì)胞穿透活性（圖5b）。含TAMRA（15）的衍生物與HeLa細(xì)胞孵育后細(xì)胞共聚焦成像顯示胞漿和細(xì)胞核內(nèi)有彌漫性熒光。這些實(shí)驗(yàn)表明，Linker不會(huì)破壞肽的細(xì)胞穿透活性和進(jìn)入胞漿。
Figure 5
結(jié) 論
作者闡述了仲氨基醇作為一類新的可裂解Linker。（Iso）seramox在肽庫篩選方面具有廣泛的適用性。在樹脂上合成過程中，（Iso）seramox linkers可以被接入肽中。這些仲氨基醇的裂解速度比已知的二醇linker快。此外，isoseramox是無痕、高碘酸鹽標(biāo)簽連接劑的第一個(gè)例子，裂解后釋放出N-端游離的多肽。
在肽庫的合成、捕獲和釋放過程中，證明了isoseramox具有廣泛的底物相容性。此外，isoseramox有助于肽進(jìn)入細(xì)胞后的釋放。
作者認(rèn)為，isoseramox不僅在發(fā)現(xiàn)功能性肽和擬肽組分方面有好的效果，而且在小分子和聚合物應(yīng)用中也將是有價(jià)值的工具。
文獻(xiàn)整理：Linhao
原文鏈接：doi.org/10.1002/anie.202003478
