今天給大家推薦的文章是最近發(fā)表在Nature Communications上的Light-induced primary amines and o-nitrobenzyl alcohols cyclization as a versatile photoclick reaction for modular conjugation，文章的通訊作者是中國科學(xué)院大學(xué)和中科院上海藥物研究所的陳小華研究員。
點(diǎn)擊化學(xué)作為一種簡便、高效、快速的反應(yīng)類型，在合成化學(xué)，尤其當(dāng)今在生物研究、模型藥物研究、納米技術(shù)與材料科學(xué)等領(lǐng)域，具有十分重要的地位。在近十年間，科學(xué)家們在點(diǎn)擊化學(xué)領(lǐng)域進(jìn)行了諸多研究，其中生物正交的點(diǎn)擊反應(yīng)始終是藥化等領(lǐng)域的有力工具，常見的生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)包括NCL反應(yīng)，胺生物偶聯(lián)，以及硫(IV)-氟交換反應(yīng)等。然而，此類自發(fā)生物偶聯(lián)點(diǎn)擊反應(yīng)在復(fù)雜的生物環(huán)境中一般來說仍然難以做到定時定點(diǎn)反應(yīng)。
光活化是一種十分理想的化學(xué)反應(yīng)途徑，其優(yōu)勢包括操作便捷、無需有害金屬離子及配體參與、高時間與空間分辨率等。近來，在時空精準(zhǔn)的光誘導(dǎo)點(diǎn)擊化學(xué)方面，雖然科學(xué)家們已經(jīng)有了許多發(fā)現(xiàn)，但能夠?qū)嶋H投入應(yīng)用的依舊有限，常見的有四氮唑的光點(diǎn)擊反應(yīng)已經(jīng)被應(yīng)用在材料領(lǐng)域和生物體系中。一般光點(diǎn)擊反應(yīng)中需要解決的主要問題包括反應(yīng)選擇性，以及量子產(chǎn)率的提高，即高效性等。另外，諸多光點(diǎn)擊反應(yīng)前體的復(fù)雜實(shí)驗(yàn)室合成方法也限制了其應(yīng)用。
在此，作者介紹了一類采用鄰硝基芐醇（o-NBAs）與一級胺進(jìn)行環(huán)化的光點(diǎn)擊反應(yīng)（PANAC），該反應(yīng)能夠在溫和的條件下高效進(jìn)行，并且適用范圍廣泛，具有相當(dāng)?shù)臅r空可控性與化學(xué)選擇性，反應(yīng)前體同樣簡單易得（圖1）。因此，PANAC化學(xué)為分子偶聯(lián)提供了一類新的簡單高效易操作的點(diǎn)擊化學(xué)平臺。
圖1. PANAC反應(yīng)示意圖
在文章中，作者在對帶有芳環(huán)的光活性底物的篩選中發(fā)現(xiàn)，芳環(huán)上的取代基極大影響著反應(yīng)效率。而帶有吸電子酰胺鍵取代的底物能夠與一級胺實(shí)現(xiàn)最高的反應(yīng)產(chǎn)率（圖2c）。通過對反應(yīng)的研究，證明了該反應(yīng)在瞬時光照后即可快速生成亞硝基苯中間體，并且在隨后的幾分鐘內(nèi)穩(wěn)定反應(yīng)，（圖2d, e）最終在近中性及弱堿性條件下實(shí)現(xiàn)目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)率，且在極低底物濃度下已經(jīng)能夠順利高產(chǎn)率反應(yīng)（圖2f）。
圖2. 對PANAC模型反應(yīng)的篩選與優(yōu)化
在對體系底物廣泛性與基團(tuán)耐受性的實(shí)驗(yàn)中，作者證明了多種小分子藥物或類似物（例如氨氯地平，阿霉素，3’-氨基-3’-脫氧胸腺嘧啶）能夠幾乎定量反應(yīng)。此外，在醇、酚、羧酸、二級及三級胺、含氮雜環(huán)存在的條件下，反應(yīng)均能夠以極高產(chǎn)率完成。
隨后，作者采用PANAC方法對未保護(hù)的肽段進(jìn)行了標(biāo)記與環(huán)化偶聯(lián)，并實(shí)現(xiàn)了時間控制。采用未保護(hù)的肽段進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，作者首先發(fā)現(xiàn)了PANAC反應(yīng)在肽段中對賴氨酸的高選擇性（圖3a）。并且根據(jù)圖3b，在同一體系中沒有光照的條件下，PANAC反應(yīng)并不會發(fā)生。在圖中所示半胱氨酸殘基上的巰基反應(yīng)，或酪氨酸殘基上的酚羥基反應(yīng)結(jié)束之后對體系進(jìn)行光照，PANAC反應(yīng)方才發(fā)生。由此可見，該反應(yīng)也能夠簡化肽段與蛋白的保護(hù)-脫保護(hù)步驟，使操作合成更加高效簡潔。與之相比，例如活化酯與芳基磺酰氟之間的點(diǎn)擊反應(yīng)受到其他親核基團(tuán)的干擾更大。
圖3. PANAC在未保護(hù)肽段上的標(biāo)記與環(huán)化反應(yīng)
隨后，作者以天然蛋白為目標(biāo)反應(yīng)物，進(jìn)行了PANAC生物偶聯(lián)反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)。作者采用nanobody-HER2為模型蛋白對其進(jìn)行標(biāo)記（圖4a），反應(yīng)在30分鐘內(nèi)完成。胰蛋白酶消化蛋白后進(jìn)行質(zhì)譜表征分析與凝膠電泳-熒光分析，顯示反應(yīng)為賴氨酸位點(diǎn)特異，且反應(yīng)完全（圖4b, c, d）。另外，對進(jìn)行過修飾的天然蛋白，例如肌紅蛋白，溶菌酶與α-糜蛋白酶原A，同樣有良好的偶聯(lián)結(jié)果（圖4e）。隨后測試進(jìn)過修飾的nanobody-HER2與SK-Br-3細(xì)胞系的結(jié)合能力，以HER2陰性的MDA-MB-468細(xì)胞為對照，顯示PANAC修飾不影響HER2的蛋白活性（圖4f）。同樣采用HER2，作者還采用局部光照的方法證明了PANAC反應(yīng)能夠?qū)崿F(xiàn)的空間可控性（圖5）。
圖4. 以HER2為模型，PANAC生物偶聯(lián)反應(yīng)的體外實(shí)驗(yàn)
圖5. 以HER2為模型，PANAC生物偶聯(lián)反應(yīng)的空間可控性
最后，作者評估了PANAC方法的生物相容性。其中的主要擔(dān)憂在于強(qiáng)光輻射可能對細(xì)胞狀態(tài)有害。所幸短時間的365 nm光輻照在不傷害細(xì)胞狀態(tài)的條件下，能夠在1-4 μM濃度鄰硝基芐醇底物的條件下完成偶聯(lián)反應(yīng)，并且能采用與先前類似的方法完成光誘導(dǎo)的活細(xì)胞內(nèi)內(nèi)源性激酶與線粒體的靶向標(biāo)記。
綜上，作者在本文中介紹的新型生物正交點(diǎn)擊反應(yīng)PANAC偶聯(lián)具有如下優(yōu)勢：（1）良好的生物相容性與高反應(yīng)速率；（2）擁有簡單易得，且修飾方式靈活的光活性底物；（3）時間可控；（4）優(yōu)越的化學(xué)選擇性與高反應(yīng)效率；（5）能夠直接標(biāo)記天然生物分子。因此，該反應(yīng)十分有望成為新一代高效生物偶聯(lián)平臺，在材料合成、生物醫(yī)藥等領(lǐng)域均有廣泛應(yīng)用前景。
作者：ZY 審校：ZZC
DOI: 10.1038/s41467-020-19274-y
Link: https://www.nature.com/articles/s41467-020-19274-y
