研究背景
酯作為一類重要的經(jīng)濟化學(xué)品，廣泛應(yīng)用于香料、調(diào)味劑、化妝品、肥皂、藥物和除草劑等。以往的文獻報導(dǎo)中，羧酸還原酶(CAR)是一種能將羧酸轉(zhuǎn)化為醛的酶，而在水條件下的酶催化酯化反應(yīng)并不常見。本文報道了一種以ATP、Mg2+和NADPH為共底物，CAR催化的新反應(yīng)。 雖然現(xiàn)有的催化技術(shù)如Fischer酯化反應(yīng)和Steglich酯化反應(yīng)能夠有效生成酯類化合物，但這些反應(yīng)并不環(huán)保，因為它們需要使用有機溶劑、不可生物降解的催化劑和高溫條件。于是作者將目標(biāo)轉(zhuǎn)向了更為環(huán)保的CAR催化反應(yīng)。 圖1. 酵母中從葡萄糖到香草醛的合成途徑（a:3-脫氫莽草酸脫水酶; b: (Nocardia iowensis) NiCAR和O-甲基轉(zhuǎn)移酶; c:糖基轉(zhuǎn)移酶） CAR催化羧酸還原成醛（圖1），其結(jié)構(gòu)與NRPS相似。首先，ATP用于羧酸的?；?，形成?；?/span>-AMP中間體。通過硫代反應(yīng)，?；?/span>AMP中間體連接到CAR的磷酸丙氨酸(PCP)基團上后，將硫酯中間體轉(zhuǎn)移到還原酶區(qū)，在那里NADPH被用于還原，從蛋白質(zhì)中釋放出醛產(chǎn)物（圖2）。 圖2. CAR催化機理 研究內(nèi)容 作者的目標(biāo)是探索CAR除了能催化羧酸還原和酰胺化外，是否還能催化水中的酯化反應(yīng)，為將來在代謝工程細(xì)胞中的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。在上述工作的啟發(fā)下，作者首先在甲醇中進行了以苯甲酸為底物的CAR反應(yīng)。除了苯甲醛產(chǎn)物的形成外，還檢測到了一種微量的副產(chǎn)物生成，經(jīng)鑒定為苯甲酸甲酯。為了提高苯甲酸甲酯的產(chǎn)率，作者對反應(yīng)條件進行了調(diào)整，以最大限度地提高CAR生產(chǎn)酯類的能力。通過改變緩沖體系的pH來檢測pH對苯甲酸甲酯產(chǎn)率的影響。實驗發(fā)現(xiàn)，在pH為10.0的100 mM Na2CO3緩沖體系中，苯甲酸甲酯的產(chǎn)率最高，為0.59%（表1）。 表1. pH對苯甲酸甲酯生成的影響 隨后，根據(jù)CAR的催化機理——反應(yīng)的第一步是形成酰基-AMP和?；?/span>-PCP來激活羰基，從而更容易受到親核進攻，作者推測大多數(shù)酯化反應(yīng)還需要活化羧酸以促進親核加成。于是作者將有助于激活羧酸的化合物添加到緩沖液中并監(jiān)測了所有反應(yīng)將肉桂酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸甲酯的情況（表2）。 表2. 利于激活羧酸的化合物對肉桂酸甲酯形成的影響 結(jié)果表明，在以上七種添加的化合物中，濃度為100 mM的咪唑是提高肉桂酸甲酯產(chǎn)量的最有效化合物（表2）。其作為獨立緩沖液的最佳濃度為200 mM（圖3）。 圖3. 咪唑緩沖液濃度對肉桂酸甲酯產(chǎn)率的影響 其次，作者考察了溫度及甲醇濃度對肉桂酸甲酯產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明，CAR在溫和的溫度下工作效率最高，即25?C（圖4）以及當(dāng)甲醇濃度高于5.5%時，肉桂酸甲酯的產(chǎn)率下降，這可能是由于其對CAR的抑制作用（圖5）。 圖4. 溫度對肉桂酸轉(zhuǎn)化為肉桂酸甲酯的影響 圖5. 甲醇濃度對肉桂酸酯化反應(yīng)的影響 咪唑作為提高肉桂酸甲酯產(chǎn)量的最有效化合物，使得作者對其促進CAR催化酯化的機理進行了進一步研究。作者推測咪唑或與酰基-AMP中間體反應(yīng)生成?；溥颍瑥亩阅撤N方式加速酯化反應(yīng)，或作為酯化反應(yīng)的酸/堿催化劑（圖6）。 圖6. 1) 咪唑與酰基-AMP中間體反應(yīng)生成?；溥?/span> 2) 作為酯化反應(yīng)的酸/堿催化劑 實驗證明，在沒有咪唑的情況下，CAR不能將肉桂咪唑和乙醇轉(zhuǎn)化為酯，從而排除了?；溥蚴?/span>CAR催化酯化反應(yīng)的中間體的可能性。這些數(shù)據(jù)表明，咪唑很可能在酯化過程中作為一種普通的酸/堿催化劑來介導(dǎo)質(zhì)子轉(zhuǎn)移（圖7）。 圖7. Buffer A: 100 mM Na2CO3 pH 10.0; Buffer B: 200 mM Imidazole pH 10.0 為了闡明還原酶區(qū)和PCP基團在CAR催化酯化反應(yīng)中的作用，作者比較了trCAR（去除還原酶區(qū)的CAR）和S685A apoCAR （不能連接PCP）突變體以及S685A trCAR（不能連接PCP且去除了還原酶區(qū)）突變體對酯化反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，所有酶的活性相似，表明還原酶區(qū)和PCP基團不參與酯化反應(yīng)（圖8)。 圖8. 突變后的CAR對酯化反應(yīng)的影響 為了探索CAR在水環(huán)境中與其他已知催化酯化反應(yīng)的酶相比的底物寬泛性和對反應(yīng)條件的偏好，作者探索了CAR與脂肪酶（Novozyme 435）和MsAcT在類似條件下的酯化反應(yīng)（表3）。 結(jié)果表明，脂肪酶在水環(huán)境下（產(chǎn)物生成量為0-2%）不能催化有效的酯化反應(yīng)，而CAR可以有效催化酯化反應(yīng)（產(chǎn)物生成量為3.5-43%），其中包括抗炎劑（阿魏酸甲酯）、具有煙草花葉病毒抑制活性的酯（4-羥基苯乙酸甲酯）、含鹵素的酯（2，4-二氯苯氧乙酸甲酯）以及FDA批準(zhǔn)的防曬活性成分（肉桂酸）(表3)。而在MsAcT催化酯化反應(yīng)中，這些較大體積酸的直接酯化反應(yīng)明顯受阻。結(jié)果表明，在水相條件下，CAR在直接酯化反應(yīng)中明顯優(yōu)于脂肪酶和MsAcT，特別是在以大體積芳香酸為底物的直接酯化反應(yīng)中，CAR的催化效果明顯優(yōu)于脂肪酶和MsAcT。（表3） 表3. CAR與脂肪酶和MsAcT 總結(jié) 綜上所述，羧酸還原酶CAR能夠在25?C溫和的水溶液條件下將羧酸轉(zhuǎn)化為酯，具有較寬的底物范圍。CAR的這種新活性可用于全細(xì)胞生物催化劑或代謝工程應(yīng)用來合成酯，因為它在pH為7.5時也能很好地發(fā)揮作用。然而，CAR的缺點是使用昂貴的ATP作為共基質(zhì)，這在未來需要進一步的工藝優(yōu)化。
