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摘要
在合成和生物催化領(lǐng)域中，可以催化脂肪族碳的鹵化酶引起了極大的興趣。該文闡明了AoiQ的反應(yīng)機(jī)理，AoiQ是一種黃素依賴(lài)性鹵化酶（FDH），在dichlorodiaporthin生物合成過(guò)程中，可催化1,3-二酮底物的偕二鹵化反應(yīng)。 AoiQ是第一個(gè)通過(guò)體外生化實(shí)驗(yàn)闡明能夠鹵化脂肪族底物的FDH。
02 內(nèi)容 鹵代化合物的應(yīng)用范圍很廣，當(dāng)今許多最暢銷(xiāo)的藥物和農(nóng)用化學(xué)品都含有鹵素原子。鹵代可以改善生物活性，此外，鹵素化合物也是在有機(jī)合成中的重要作用。通常，諸如甲基的脂族烴的碳?xì)滏I是化學(xué)惰性的，如何區(qū)域選擇型的引入鹵原子是現(xiàn)在催化學(xué)家們的研究熱點(diǎn)。自然界中，通常non-heme-鐵依賴(lài)型的α-kg鹵化酶通過(guò)自由基的機(jī)制催化惰性碳?xì)滏I鹵化反應(yīng)。FDH通過(guò)親電取代機(jī)制催化芳香族鹵化反應(yīng)，而關(guān)于其催化碳?xì)滏I的鹵化報(bào)道較少。Chankhamjon等人前期報(bào)道了一種雙功能FDH-MT融合蛋白AoiQ催化orthosporin (4) 的氯化反應(yīng)產(chǎn)生化合物1-3。化合物4氯化位點(diǎn)的碳?xì)滏I是惰性的，在C11生成親核試劑有悖于傳統(tǒng)的FDH的親電取代機(jī)制。作者推測(cè)AoiQ通過(guò)自由基機(jī)理催化4到2的氯化。因此，進(jìn)一步研究鹵化機(jī)制十分必要。 Chankhamjon前期報(bào)道aoiQ和diaporthin的生物合成基因簇aoi位于不同的染色體上。在對(duì)AoiQ的研究中，作者發(fā)現(xiàn)aoiQ位于另一BGC（dia）中，該簇編碼NRPKS（diaA），內(nèi)酰胺（diaB），SDR diaC和FMO diaD。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)dia同源簇保守存在于其他真菌中，包括dichlorodiaporthin的產(chǎn)生菌株，但aoi不保守。 為了驗(yàn)證AoiQ在aoi和dia基因簇中的功能，作者在A. nidulans中異源表達(dá)了這兩個(gè)簇。當(dāng)aoiG和aoiF與 aoiQ共表達(dá)時(shí)，未觀察到氯化產(chǎn)物，而觀察到了單和二甲基化的diaporthin 化合物5和7。相反，當(dāng)DiaA和DiaB與 aoiQ共表達(dá)時(shí)，可以觀察到氯化產(chǎn)物1。這些結(jié)果表明， dia是dichlorodiaporthin的實(shí)際生物合成基因簇。由于A. nidulans也具有該簇，因此作者在酵母中進(jìn)一步異源表達(dá)該簇以避免cross-talk。當(dāng)表達(dá)DiaA和DiaB時(shí)，作者可以觀察到6及其還原產(chǎn)物8和9，8和9由內(nèi)源性還原酶催化的。 6具有1，3-二酮部分，其可以作為dichlorodiaporthin的前體。因此，作者共表達(dá)了DiaAB與AoiQ，然而只能檢測(cè)到痕量的1，而6被完全消耗。當(dāng)共表達(dá)DiaC SDR時(shí)，可以觀察到1作為主要氯化產(chǎn)物。因此，作者推測(cè)SDR的原本功能是還原AoiQ的催化產(chǎn)物。當(dāng)表達(dá)DiaABC時(shí)，僅觀察到C10還原的化合物8，表明DiaC區(qū)域選擇性的還原C10酮羰基。 接著，作者分別體外表達(dá)了AoiQ的MT和FDH結(jié)構(gòu)域蛋白。當(dāng) AoiQ-FDH和DiaC酶與底物6進(jìn)行體外反應(yīng)時(shí)，可以檢測(cè)到鹵代產(chǎn)物產(chǎn)物2和12，證實(shí)了二酮是AoiQ的實(shí)際底物。 由底物6轉(zhuǎn)化成2需要經(jīng)過(guò)氯化，脫乙酰和酮還原反應(yīng)。 為了解脫?；襟E，作者化學(xué)合成了化合物15，在體外反應(yīng)緩沖液中， 15自發(fā)轉(zhuǎn)化為α-鹵代酮16，這表明脫乙?；磻?yīng)為非酶促反應(yīng)。 添加AoiQ-FDH和DiaC可產(chǎn)生 2，這表明15為生物合成中間體。該反應(yīng)可能是由水攻擊 β-羰基，然后消除a-鹵代羰甲基而發(fā)生的。 當(dāng)作者在構(gòu)巢曲霉中共表達(dá)DiaAB和AoiQ-FDH時(shí)，作者觀察到三氯代化合物19，其中5位被氯化。這一結(jié)果表明，AoiQ-FDH還可以催化芳香族氯化反應(yīng)。體外測(cè)定表明AoiQ-FDH可將 2轉(zhuǎn)化為19；也可將4，8，12分別轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的C5或C7氯代化合物。該結(jié)果表明二酮底物中的C11是優(yōu)選的親核試劑，二酮部分的缺失會(huì)導(dǎo)致其他親核試劑的氯化。由于具有不同氯化位置的化合物的保留時(shí)間和質(zhì)量相似，這可能導(dǎo)致是前期報(bào)導(dǎo)對(duì)AoiQ可作用未活化的sp3碳誤解的原因。 總而言之，該文報(bào)道了單組分FDH AoiQ可催化可烯化的1，3-二酮底物發(fā)生偕二鹵代反應(yīng)，繼而導(dǎo)致罕見(jiàn)聚酮縮短反應(yīng)。對(duì) AoiQ作用機(jī)制的研究對(duì)拓展其用于生物催化領(lǐng)域生產(chǎn)鹵代非芳香化合物奠定了基礎(chǔ)。 華中科技大學(xué)藥學(xué)院張勇慧教授團(tuán)隊(duì)博士生劉夢(mèng)婷為該文的第一作者。加州大學(xué)洛杉磯分校（UCLA）的Yi Tang教授，Masao Ohashi 研究員以及HKI的Christian Hertweck教授為該文的通訊作者 。
