英文原題：Concerted Chemoenzymatic Synthesis of α-Keto Acid through Compartmentalizing and Channeling of Metal-Organic Frameworks
通訊作者：Jiafu Shi (石家福)，Zhongyi Jiang (姜忠義)，天津大學
第一作者：Yizhou Wu (伍一洲)
生物制造是以生物技術為核心，利用酶或微生物細胞，結合化學工程技術進行目標產品的加工過程(綠色生物制造. 北京化工大學學報, 2018, 45, 107)。酶催化因反應條件溫和、活性高、目標產物選擇性高等特點，在綠色生物制造領域表現(xiàn)出廣闊的應用前景。定向進化、合成生物學等新興技術的出現(xiàn)進一步拓寬了酶催化的反應條件和反應類型。然而，酶的一些固有特性，如氧化還原酶依賴輔酶，氧化酶易產生有毒副產物等，限制了酶催化的應用范圍?；瘜W催化劑，例如貴金屬、金屬氧化物和有機金屬配合物等，已廣泛應用于多種化學反應。因此，研究者將酶催化與化學催化偶聯(lián)，結合酶催化劑高活性、高特異性與化學催化劑易獲取和多樣性等優(yōu)勢，開發(fā)了酶-化學偶聯(lián)催化系統(tǒng)，拓寬了反應路徑、促進了副產物消除，提升了反應效率，實現(xiàn)了燃料、精細化學品和藥物中間體的高效合成。
酶-化學偶聯(lián)催化過程的全局效率主要受兩個因素影響：即(1)酶催化劑和化學催化劑的固有活力與(2)酶催化過程與化學催化過程間的底物傳遞(反應物，中間產物或副產物)。構建酶-化學偶聯(lián)催化系統(tǒng)的難點在于酶催化與化學催化反應條件不同，兩種催化劑直接接觸會引起催化劑中毒或失活，如酶催化劑的構象易受化學催化劑破壞。開發(fā)與酶催化劑兼容性強的化學催化劑可在一定程度保持酶活性。然而，該方法通常僅適用于少數(shù)酶催化劑。為此，研究者利用微囊膜或電解池空間分隔酶催化劑與化學催化劑，提升二者相容性。但并未考慮催化過程間物質傳輸。而這一點恰恰也是影響酶-化學偶聯(lián)催化過程全局效率的關鍵。理論上講，在酶催化劑與化學催化劑間構建底物通道可促進物質傳遞，提升全局效率。遺憾的是，同時協(xié)調酶催化劑與化學催化劑間相容性和物質傳遞以構建酶-化學偶聯(lián)催化系統(tǒng)的策略鮮有報道。
生物體精巧的結構使其在進行復雜多催化過程時仍保持著高效的物質交換速率。在光合作用光反應中，水氧化和NADPH再生反應分別發(fā)生在類囊體膜的囊腔和基質側。析氧反應中心Mn4CaO5在囊腔側首先將水分解為氧氣、質子和電子。質子和電子經(jīng)過跨膜運輸傳遞到基質側參與由鐵氧還蛋白-NADP還原酶(FNR)催化的NADPH再生反應。電子通過Z-Scheme電子傳遞鏈，經(jīng)光系統(tǒng)II，細胞色素和光系統(tǒng)I傳遞到FNR；同時，“質子泵”ATP合成酶將質子從囊腔側運輸?shù)交?，?/span>NADPH再生提供質子源。將水氧化和NADPH再生過程進行“隔室化”避免了高活性反應中心Mn4CaO5和FNR接觸而引起的失活。電子和質子通道則保證了NADPH再生過程的能量和物質供給。相容性和能量/物質傳遞的協(xié)同強化確保了光反應過程的高效、持續(xù)進行。
受光合作用光反應作用機制啟發(fā)，我們提出了“隔室化-通道化”策略來構建酶-化學偶聯(lián)催化系統(tǒng)，以協(xié)調催化劑相容性和催化過程的物質傳遞(ACS Catal. 2020, 10, 9664)。金屬有機框架(MOFs)因具有可設計的結構單元、豐富的配位位點、開放的框架結構和埃及孔道尺寸，已被廣泛應用于固定化酶領域。此外，MOFs材料在構建復雜催化系統(tǒng)方面也很有潛力。酶催化劑和化學催化劑的“隔室化”可由框架結構實現(xiàn)，小分子底物的“通道化”則可通過調節(jié)孔道尺寸實現(xiàn)。本研究選擇L-氨基酸氧化酶(LAAO)催化氨基酸氧化和Pt催化H2O2降解反應來構建酶-化學偶聯(lián)催化系統(tǒng)。LAAO主要用于催化氨基酸氧化生成α-酮酸。然而，催化過程的副產物H2O2會引起α-酮酸脫羧過氧化，從而降低目標產物轉化率。由于其生物毒性，H2O2的累積也可能導致酶失活。Pt納米顆粒是促進H2O2分解的高效化學催化劑。將Pt納米顆粒與LAAO偶聯(lián)，可以消除H2O2以實現(xiàn)α-酮酸的持續(xù)合成。本研究選用UiO-66作為載體，構建了內負載Pt納米顆粒-外吸附LAAO酶-化學偶聯(lián)催化劑Pt@UiO@LAAO(PUL)。其中，UiO-66的固有孔(0.8 nm和1.4 nm)可實現(xiàn)兩種催化劑分隔，同時確保底物H2O2在孔道內的自由擴散。通過對Pt納米顆粒的位置和負載量進行調控，實現(xiàn)了催化劑間相容性和物質傳遞的協(xié)同強化，獲得了99.7%的α-酮酸收率，較游離LAAO高出2倍以上(41.2%)。
圖1. 酶-化學偶聯(lián)催化合成α-酮酸示意圖。
采用溶劑熱法合成了Pt@UiO@LAAO酶-化學偶聯(lián)催化劑，通過TEM mapping、HRTEM和CLSM(SI)等表征證明了內負載Pt納米顆粒與外吸附L-氨基酸氧化酶。
圖2. (a)Pt@UiO@LAAO (PUL) 制備過程示意圖；(b-e)PUL催化劑元素分布；(f-g)PUL催化劑邊緣和中心TEM照片。(h-i)PUL催化劑SEM照片。
PUL催化L-谷氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸：L-氨基酸氧化酶首先將L-谷氨酸轉化為對應亞氨基酸，同時產生副產物H2O2，亞氨基酸經(jīng)無酶水解反應生成吲哚-3-丙酮酸；Pt納米顆粒催化H2O2分解，防止其氧化吲哚-3-丙酮酸脫羧生成吲哚-3-乙酸。
圖3. (a)PUL催化合成α-酮酸過程示意； UiO@LAAO、PUL、UiO@Pt-LAAO和游離LAAO催化合成α-酮酸(b)隨時間收率以及(c)初始反應速率與產率對比。
PUL催化L-谷氨酸轉化為吲哚-3-丙酮酸反應效率主要受兩方面影響：(1)LAAO催化L-谷氨酸氧化速率；(2)Pt納米顆粒催化H2O2分解速率?；诖?，本研究測試了對應催化劑的H2O2分解速率，并通過圓二色譜圖分析了酶催化劑與化學催化劑發(fā)生相互作用后的構象變化，以分析酶催化反應的本征速率。在PUL催化劑中，“通道化”可滿足H2O2在UiO孔道內的自由擴散，“隔室化”則阻止了LAAO與Pt納米顆粒的直接接觸，以保持LAAO活力在較高水平。
圖4. (a)Pt@UiO、UiO@Pt和Pt催化H2O2降解活性；(b)LAAO和Pt處理過LAAO圓二色譜圖；游離LAAO和LAAO與UiO、Pt@UiO或UiO@Pt孵化4小時后的(c)圓二色譜圖及(d)對應二級結構含量圖。
通過調控Pt納米顆粒的負載量和位置，實現(xiàn)了LAAO催化L-谷氨酸氧化速率和Pt納米顆粒催化H2O2分解速率的匹配，吲哚-3-丙酮酸收率最高達99.7%(5小時)。并通過系列圓二色譜圖，對LAAO失活機理進行了推測。Pt納米顆粒具有強質子親和性，易與LAAO外部肽鏈形成氫鍵，促使LAAO外部α-螺旋和β-轉角打開；被打開的肽鏈重新通過側鏈氫鍵連接形成β-折疊。在LAAO中，在FAD結合區(qū)和螺旋區(qū)域間的疏水通道連接著底物反應腔室與外部環(huán)境，用于將O2從LAAO外部運輸?shù)交钚晕稽c。α-螺旋和β-轉角結構的破壞可能會造成O2運輸通道的損壞，使FADH-2無法被氧化為FAD，終止了氨基酸氧化反應。
圖5.(a)高Pt和低Pt負載量PUL示意圖；(b)PUL(0.01)、PUL(0.1)、PUL(1)和PUL(5)催化合成IPA隨時間收率及(c)Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(1)和Pt@UiO(5)催化H2O2降解活性；(d)PUL(0.01)、PUL(0.1)、PUL(1)和PUL(5)催化合成IPA初始反應速率；游離LAAO和LAAO與Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(0.01)、Pt@UiO(1)和Pt@UiO(5)孵化后的(e)圓二色譜圖及(f)對應二級結構含量圖。
本研究工作由天津大學姜忠義教授、石家福副教授團隊完成，得到了新南威爾士大學梁康研究員的指導和幫助。該團隊長期致力于生物催化、酶-光(化學)偶聯(lián)催化等研究，曾將“隔室化-通道化”策略成功應用于多酶催化系統(tǒng)構建和應用過程(Adv. Funct. Mater. 2013, 23, 1450; ACS Catal. 2014, 4, 962; Chem. Soc. Rev. 2018, 47, 4295)。目前，團隊正致力于將該思想拓展至酶-光偶聯(lián)人工光合過程，并已取得積極進展。在研究過程中得到了國家自然科學基金(21621004，21776213)，天津市自然科學基金(19JCYBJC19700)，天津市合成生物技術創(chuàng)新能力提升行動項目(TSBICIP-KJGG-003)，化學工程聯(lián)合國家重點實驗室開放基金(SKL-ChE-19B01)和生化工程國家重點實驗室開放基金(2020KF-06)的支持。
ACS Catal. 2020, 10, XXX, 9664–9673
Publication Date: July 29, 2020
https://doi.org/10.1021/acscatal.0c01985
Copyright ? 2020 American Chemical Society
