利用酶對蛋白質(zhì)/肽進(jìn)行位點特異性修飾已成為研究蛋白質(zhì)/肽功能或產(chǎn)生治療性結(jié)合物的一種高度可及的、廣泛的方法。天冬酰胺基內(nèi)切肽酶（AEPs）催化轉(zhuǎn)肽基化反應(yīng)（AEP連接酶），由于其催化效率和短的三肽識別基序，已成為細(xì)菌分類酶sortase A的良好替代品。然而，在標(biāo)準(zhǔn)條件下要達(dá)到理想的產(chǎn)率需要大量過量的親核試劑。
近期，澳大利亞昆士蘭大學(xué)Thomas Durek和David J. Craik課題組報告了一種通過選擇性地淬滅競爭性親核肽離去基團(tuán)的，將AEP催化的轉(zhuǎn)肽平衡轉(zhuǎn)移到產(chǎn)物形成。迄今為止，在大腸桿菌中通過重組生產(chǎn)獲得的最具催化功能的AEP連接酶是[C247A]OaAEP1，它是一種攜帶識別基序Asn-Xaa-Yaa（P1-P1'-P2'）的蛋白，其中P2'是疏水和脂肪族氨基酸（除了Val），P1'殘基是小分子氨基酸（例如Gly），它可以使用比底物少200-1000倍的量并用合適的親核肽有效負(fù)載連接對底物C末端修飾。
圖片來源：Angew. Chem. Int. Ed.
N-末端二肽親核序列（例如Gly-Leu）的蛋白N-末端修飾可以通過裝載Asn-Gly-Leu來實現(xiàn)。[C247A]OaAEP1的識別序列非常嚴(yán)格，而對于引入的親核序列是混雜的。AEP連接酶可以識別一種替代的親核序列（Gly-Val），這種序列產(chǎn)生的產(chǎn)物（Asn-Gly-Val）與Asn-Gly-Leu或Asn-Gly-Ile基序相比識別率很低，從而減少了再識別概率。然而，為了首先產(chǎn)生這種目標(biāo)產(chǎn)物，需要用相對于蛋白來說大量過量（>20倍）的底物Gly-Val親核蛋白來競爭性從底物釋放離去基團(tuán)Gly-Leu。這說明淬滅競爭的親核肽可以推動轉(zhuǎn)肽反應(yīng)完成，并提高AEP連接酶的催化能力。通過金屬絡(luò)合將這種潛在的親核猝滅作用應(yīng)用于[C247A]OaAEP1催化的連接反應(yīng)中，Gly-Leu-His離去基團(tuán)也必須是有能力的金屬結(jié)合序列。因此，合成了兩種模式肽(GGHGGR 和GLHGGR)，并通過核磁氫譜鑒定它們與Ni2+的結(jié)合能力。
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Gly-Leu-His作為金屬離子絡(luò)合基序，[C247A]OaAEP1催化模式底物KKGKGWTWNGLH。結(jié)果表明，當(dāng)加入Ni2+后產(chǎn)物明顯增加。
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接下來，試圖用這種方法應(yīng)用于蛋白-肽結(jié)合反應(yīng)的增強。當(dāng)僅使用2摩爾當(dāng)量的肽探針時，所有蛋白質(zhì)在Ni2+增強反應(yīng)中都有75%的修飾。
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為了評估這種親核猝滅方法是否能超越簡單的肽或蛋白肽結(jié)合反應(yīng)，從而進(jìn)一步研究了折疊蛋白底物相互之間的連接。實驗結(jié)果表明，該方法可以增強蛋白與蛋白間的連接，甚至有助于形成難以獲得的寡蛋白產(chǎn)物。
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參考文獻(xiàn)：Improved Asparaginyl-Ligase-Catalyzed Transpeptidation via SelectiveNucleophile Quenching
Angew. Chem. Int. Ed.
DOI：10.1002/anie.202013584
原文作者：Fabian B. H. Rehm+, Tristan J. Tyler+, Kuok Yap, Thomas Durek,* andDavid J. Craik*
