圖片來源：Angew.Chem. Int. Ed.
石膽酸（LCA）是肉類生產(chǎn)中一種豐富而廉價的廢物，這種膽汁酸存在于綿羊、牛和豬等養(yǎng)殖動物中。目前，還沒有石膽酸作為合成UDCA的起始原料的生物技術(shù)，只有少數(shù)微生物中存在LCA轉(zhuǎn)化成UDCA的報道。單加氧酶CYP107D1（OleP）參與oleandomycin生物合成途徑中的環(huán)氧化反應(yīng)，后被發(fā)現(xiàn)也能識別12元大環(huán)內(nèi)酯作為底物。OleP能使睪酮在6β、7β、12β和15β處羥基化，但對LCA等膽汁酸僅在6β位羥基化，形成MDCA。
圖片來源：Angew.Chem. Int. Ed.
近期，格賴夫斯瓦爾德大學(xué)的Uwe T. Bornscheuer課題組利用蛋白質(zhì)工程，改造OleP的區(qū)域選擇性，使得OleP能催化LCA轉(zhuǎn)化為UDCA。首先是將LCA作為底物與OleP蛋白結(jié)構(gòu)進行底物對接，分析底物與氨基酸殘基的相互作用。在對接處5–14?的范圍內(nèi)選擇了24個氨基酸殘基，除去本身是丙氨酸和甘氨酸的殘基，對其他20個氨基酸做丙氨酸掃描，獲得了5個能產(chǎn)生UDCA的突變體F84A，V93A，L94A，S240A，和V291A。
圖片來源：Angew.Chem. Int. Ed.
進一步地，利用生物信息學(xué)工具“3DM”集中位點F84，S240，和V291構(gòu)建一個包含4480個突變體的小突變體文庫，并篩庫篩選出一個三突變體F84Q/S240A/V291D，其區(qū)域選擇性可達到72.8%。此外，從結(jié)構(gòu)上看，由于V291是疏水性裂隙的一部分，其突變?yōu)楦拾彼峥赡苡欣?span style="background-image: initial; background-position: initial; background-size: initial; background-repeat: initial; background-attachment: initial; background-origin: initial; background-clip: initial; font-family: Calibri, sans-serif;">C7羥基化。結(jié)果是，將V291突變成V291G后，三突變F84Q/S240A/V291G的區(qū)域選擇性大幅度提高。
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綜上，該研究成功地設(shè)計了P450單加氧酶OleP，用于LCA的區(qū)域和立體選擇性7β羥基化以形成UDCA。
參考文獻：Engineering Regioselectivity of a P450 Monooxygenase Enables theSynthesis of Ursodeoxycholic Acid via 7β-Hydroxylation of Lithocholic Acid
Angew. Chem. Int. Ed.
DOI: 10.1002/anie.202012675
原文作者：Sascha Grobe, Christoffel P. S. Badenhorst, Thomas Bayer, EmilHamnevik, Shuke Wu, Christoph W. Grathwol, Andreas Link, Sven Koban, HenrikeBrundiek, Beatrice Gro?johann, and Uwe T. Bornscheuer*
