目前的研究發(fā)現(xiàn)在癌細胞內(nèi)大量檢測到G-四聯(lián)體（G4s），這可能與癌癥相關(guān)基因關(guān)系密切，并且推測G4s或許可以用作早期癌癥診斷和治療中新的分子靶標。之前有關(guān)G4s的研究報道中所使用的觀察技術(shù)往往需要殺死細胞或使用高濃度的化學(xué)探針，從而觀察G4s的形成。但由于細胞中G4s的穩(wěn)態(tài)性可能受到蛋白質(zhì)（例如解旋酶的調(diào)節(jié)），無法通過快速離體技術(shù)來追蹤G4s。此外，一些常用于檢測活細胞中DNA和RNA的探針濃度相對較高，這可能會干擾G4s的動態(tài)折疊過程以及引起細胞應(yīng)激/毒性。
近日，英國劍橋大學(xué)化學(xué)與癌癥研究系的Shankar Balasubramanian教授課題組在Nature Chemistry上發(fā)表了一篇題為《Single-molecule visualization of DNA G-quadruplex formation in live cells》的研究論文。該研究報道了一種G4特異性熒光探針（SiR-PyPDS）能在低濃度的條件下，結(jié)合少量G4s就可以實時追蹤到活細胞核中的G4s的單個結(jié)構(gòu)分子，實現(xiàn)了在不干擾G4s動態(tài)折疊的情況下，在活細胞中對其動態(tài)過程進行檢測。此外，還證明了活細胞中G4s的形成是細胞周期依賴性的，并受到化學(xué)抑制轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的破壞。
圖1 G4s的體外單分子熒光成像。（a）G4結(jié)構(gòu)（左）和G4二級結(jié)構(gòu)（右）的示意圖。（b）(1) G4特異性熒光探針（SiR-PyPDS）的化學(xué)結(jié)構(gòu)以及它的非活性異構(gòu)體SiR-iPyPDS(2)。SiR-PyPDS(1)是通過使用不同長度的連接體將遠紅色熒光團硅羅丹明（SiR）與G4配體吡啶酮（PyPDS）的類似物結(jié)合制備得到的。熒光滴定證實SiR-iPyPDS(2)的G4結(jié)合親和力比SiR-PyPDS(1)低10倍以上。（c）用于可視化單個G4的方法的示意圖。預(yù)折疊的G4-MYC通過生物素-中性親和素鏈接體連接到蓋玻片上。G4熒光探針SiR-PyPDS(1)與G4-MYC結(jié)合，可通過單分子熒光成像進行觀察。（d）SiR-PyPDS不結(jié)合G4形成單鏈突變體MYC。（e）非活性異構(gòu)體SiR-iPyPDS(2)結(jié)合親和力較弱，與G4 MYC結(jié)合的可能性較小。（f）定量檢測SiR-PyPDS (1)與G4 MYC的結(jié)合，SiR-PyPDS (1)與突變體MYC (Mut)的結(jié)合，SiR-iPyPDS (2)與G4 MYC的結(jié)合，以及在10μM未標記的PhenDC3存在的條件下，SiR-PyPDS (1)與G4 MYC的結(jié)合。（g）單個SiR-PyPDS(1)分子(250 pM)結(jié)合表面的預(yù)折疊MYC G4寡核苷酸的成像，單個熒光點狀物表明有單一的SiR-PyPDS(1)分子結(jié)合。（h）SiR-PyPDS(1) (250 pM)與突變體MYC結(jié)合的成像。（i）SiR-iPyPDS (2) (250 pM)與預(yù)折疊MYC結(jié)合的成像。（j）G4配體與G4s的相互作用可以改變G4s展開和折疊之間的平衡。
圖2用熒光探針SiR-PyPDS(1)對活細胞G4s進行單分子熒光成像。（a）細胞核內(nèi)G4s的示意圖，放大后顯示經(jīng)SiR-PyPDS染色的G4s(1)。（b）在成像前30分鐘，使用20 nM的SiR-PyPDS(1)處理的活U2OS細胞，熒光斑點表明單鏈與SiR-PyPDS(1)分子結(jié)合。藍色對應(yīng)于Hoechst 33342核染色。（c）使用20 nM的SiR-PyPDS(1)對U2OS活細胞處理30分鐘后，進行SiR-iPyPDS(2)染色的代表性圖像。（d）對于SiR-PyPDS(1)和SiR-iPyPDS(2)，對每個細胞持續(xù)超過兩幀（每幀100 ms）的細胞核內(nèi)結(jié)合現(xiàn)象的定量分析。
圖3 活細胞中的G4s的動態(tài)折疊和展開過程（a）SiR-PyPDS(1)在體外(上)和細胞內(nèi)(下)的單分子延時成像。左邊顯示的是時間推移疊加的單個圖像，右邊則顯示了SiR-PyPDS(1)與G4s的動態(tài)結(jié)合動力學(xué)。（b）每個實驗的駐留時間直方圖，用單指數(shù)擬合以確定每種條件下的結(jié)合壽命。（c）DMS對未折疊的G4s的化學(xué)捕獲的示意圖。（d）定量檢測未經(jīng)處理和經(jīng)600 μM MDMS處理的G4 NYC 20 min的G4結(jié)合事件。（e）DMS (20 mM)增加后，活細胞中檢測到G4結(jié)合事件的定量檢測，顯示出G4s明顯的時間依賴性消耗。以上結(jié)果證明，SiR-PyPDS結(jié)合G4s觀察到的時間相當，說明SiR-PyPDS可以用于檢測內(nèi)源性的G4s。
圖4 G4s在活細胞中的觀察受到細胞周期和轉(zhuǎn)錄的影響。（a）-（d），顯示了S期(a)、G1/S期(b)和G0/G1期(c)同步的U2OS細胞和同時使用轉(zhuǎn)錄抑制劑DRB和復(fù)制抑制劑阿非迪霉素(d)處理的未同步的細胞中G4結(jié)合事件的代表性單分子圖像。（e）在活的U2OS細胞中，在不同的細胞周期階段和轉(zhuǎn)錄/復(fù)制停止后，對每個細胞持續(xù)超過2幀（每幀100毫秒）的結(jié)合事件的定量。通過對活細胞中G4s的單分子可視化技術(shù),可以追蹤G4s在特定基因中的作用以及它們在癌癥中的表達方式。
該研究發(fā)明了一種熒光標記，它可以附著在人類活細胞的DNA G-四聯(lián)體(G4s)上，首次可以觀察到這種特殊的DNA結(jié)構(gòu)的形成過程，以及它在細胞中行使的功能。這一成像平臺的進一步應(yīng)用將有助于實時揭示人類基因組中由個體G4調(diào)控的特定生物學(xué)功能。
https://www.nature.com/articles/s41557-020-0506-4
Shankar Balasubramanian，印度出生的英國化學(xué)家，劍橋大學(xué)化學(xué)系藥物化學(xué)教授，英國劍橋癌癥研究所高級組長，劍橋三一學(xué)院研究員，Solexa和Cambridge Epigenetix的科學(xué)創(chuàng)始人。
編輯：今晚月色真美
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