酶活性的檢測(cè)對(duì)于臨床診斷、功能蛋白質(zhì)組學(xué)和藥物發(fā)現(xiàn)等許多應(yīng)用都具有重要意義。迄今為止，科研工作者們已經(jīng)開(kāi)發(fā)了用于檢測(cè)酶活性及篩選抑制劑的不同方法，包括質(zhì)譜、電化學(xué)、毛細(xì)管電泳、放射性標(biāo)記、比色分析和熒光方法。但當(dāng)前用于酶活性測(cè)量的方法通常具有較低的分析靈敏度。近年來(lái)，高效的小分子抑制劑已成為治療許多疾?。ɡ绨┌Y）的有效藥物，而精確分析具有亞納摩爾或皮摩爾范圍內(nèi)抑制常數(shù)（Ki）的緊密結(jié)合抑制劑需要接近或低于Ki值的低濃度酶。但較低濃度的酶產(chǎn)生的信號(hào)極弱，因此迫切需要一種可以進(jìn)行超靈酶分析的檢測(cè)技術(shù)。 近日，來(lái)自哈佛大學(xué)醫(yī)學(xué)院的病理學(xué)教授David R. Walt在國(guó)際著名期刊《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Ultrasensitive Detection of Enzymatic Activity Using Single Molecule Arrays”的研究論文。本文中，作者開(kāi)發(fā)了一種使用單分子陣列（eSimoa）檢測(cè)酶活性的超靈敏方法。利用生物功能化的磁珠捕獲目標(biāo)分析物并保證每個(gè)磁珠結(jié)合的目標(biāo)分析物為0或1。通過(guò)生物素化的檢測(cè)探針與磁珠上捕獲的目標(biāo)分析物結(jié)合，并進(jìn)一步用報(bào)告酶-鏈霉親和素-β-半乳糖苷酶（SβG）進(jìn)行標(biāo)記和分析，從而實(shí)現(xiàn)蛋白酶的超靈敏檢測(cè)。作者證明了eSimoa分析方法具有前所未有的靈敏度，可用于檢測(cè)蛋白激酶、端粒酶和多肽N-乙酰半乳糖胺基轉(zhuǎn)移酶的活性。 圖1 基于eSimoa分析方法使用多肽修飾的磁珠（MBs）作為基底檢測(cè)蛋白激酶活性的示意圖。在eSimoa分析中，將結(jié)合有底物多肽的MBs與目標(biāo)酶和輔因子共同孵育，隨后反應(yīng)得到的產(chǎn)物被生物素化的檢測(cè)探針?biāo)R(shí)別，并進(jìn)一步被SβG標(biāo)記用于Simoa分析。 圖2 檢測(cè)（A）原癌基因酪氨酸蛋白激酶（Src）和（B）Abelson小鼠白血病病毒致癌基因同源物1（Ab1）活性的響應(yīng)曲線。采用eSimoa分析方法對(duì)Src和Ab1的檢測(cè)限分別為4.9 fM和4.2 fM，相比傳統(tǒng)的方法具有較高的靈敏度。 圖3 eSimoa用于端粒酶活性檢測(cè)的示意圖。將底物寡核苷酸預(yù)綴合至MB的表面，在存在dNTP混合物的情況下，以端粒酶的固有RNA作為模板，結(jié)合的端粒酶催化端粒重復(fù)序列(TTAGGG)n加到底物的3'端。溫育和磁分離后，將結(jié)合的端粒酶洗掉，并加入由互補(bǔ)序列組成的生物素標(biāo)記的檢測(cè)探針。最后，添加SβG標(biāo)記MB用于Simoa分析。 圖4 使用Simoa分析方法檢測(cè)端粒酶活性的響應(yīng)曲線。 圖5 使用抑制劑bosutinib抑制Src（A）及Ab1（B）和使用抑制劑dasatinib抑制Src（C）及Ab1（D）的不同預(yù)孵育時(shí)間下的劑量反應(yīng)曲線。這些結(jié)果表明，eSimoa分析方法可用于評(píng)估抑制劑的效力，尤其是用于篩選緊密結(jié)合的抑制劑。 圖6 （A）K562和（B）HEK293細(xì)胞裂解液中Ab1活性檢測(cè)的條形圖。結(jié)果表明，信號(hào)隨著細(xì)胞數(shù)量的增加而增加，檢測(cè)到的最低激酶濃度對(duì)應(yīng)于從1個(gè)細(xì)胞中提取的K562濃度和從30個(gè)細(xì)胞中提取的HEK293濃度。 圖7 檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞中Bcr-Ab1的活性（A）和平均信號(hào)變化（B）。當(dāng)僅將緩沖液添加到單細(xì)胞裂解液中時(shí)，信號(hào)具有相對(duì)較寬的分布，證明了細(xì)胞之間的異質(zhì)Ab1活性。在存在抑制劑dasatinib和bosutinib的情況下，信號(hào)分布移至較低的AEB信號(hào)，并且平均信號(hào)由于抑制而降低。這些結(jié)果表明，eSimoa分析方法可用于測(cè)量單細(xì)胞中的激酶活性。 總而言之，本文作者通過(guò)將底物綴合到順磁性磁珠上并使用底物到產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化實(shí)現(xiàn)了eSimoa分析，同時(shí)采用eSimoa檢測(cè)方法成功檢測(cè)了Src，Ab1，端粒酶，SET7 / 9和GalNAcT的活性。盡管這些酶通過(guò)完全不同的機(jī)制和在不同類型的底物上起作用，但是eSimoa分析都可以實(shí)現(xiàn)酶的超靈敏檢測(cè)，這表明eSimoa方法是一種既靈敏又靈活的通用方法。并且eSimoa分析方法已成功用于確定抑制劑bosutinib和dasatinib的抑制常數(shù)。由于這種方法的超靈敏性，作者在單細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)了激酶活性的檢測(cè)并為酶相關(guān)的基礎(chǔ)研究和抑制劑篩選提供了有希望的平臺(tái)。 David R.Walt是哈佛醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系的教授，同時(shí)也是霍華德·休斯醫(yī)學(xué)院的教授，擁有密歇根大學(xué)的化學(xué)學(xué)士學(xué)位和博士學(xué)位，SUNY的化學(xué)生物學(xué)博士學(xué)位，并在MIT進(jìn)行了博士后研究。他率先將微孔陣列用于單分子檢測(cè)和分析，徹底改變了基因和蛋白質(zhì)組測(cè)序的流程，使DNA測(cè)序和基因分型的成本在過(guò)去十年中下降了近百萬(wàn)倍，并且這項(xiàng)技術(shù)現(xiàn)在已成為在各種應(yīng)用中進(jìn)行測(cè)序的金標(biāo)準(zhǔn)。他是Illumina公司和Quanterix Corp的科學(xué)創(chuàng)始人，并與其他幾家生命科學(xué)初創(chuàng)公司共同創(chuàng)立了公司。此前，他是塔夫茨大學(xué)的神經(jīng)科學(xué)與口腔醫(yī)學(xué)教授。目前他是美國(guó)國(guó)家工程研究院，美國(guó)國(guó)家醫(yī)學(xué)研究院的成員，美國(guó)藝術(shù)與科學(xué)研究院的院士，美國(guó)醫(yī)學(xué)與生物工程學(xué)院的院士以及美國(guó)發(fā)明家研究院的院士。他獲得了許多獎(jiǎng)項(xiàng)和榮譽(yù)，包括2017年美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)的凱瑟琳·C·哈赫（Kathryn C. Hach）企業(yè)家成功獎(jiǎng)，2016年的拉爾夫·亞當(dāng)斯生物分析化學(xué)獎(jiǎng)，2014年美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)古斯塔夫斯·約翰·埃瑟倫獎(jiǎng)，2013年分析化學(xué)光譜化學(xué)分析獎(jiǎng)，2013年匹茲堡分析化學(xué)獎(jiǎng)和2010 ACS國(guó)家發(fā)明創(chuàng)造獎(jiǎng)。 https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.0c06599 編輯：迷信 審核：CK
J. Am. Chem. Soc.: 使用單分子陣列實(shí)現(xiàn)酶活性的超靈敏檢測(cè)
化學(xué)試劑
新材料產(chǎn)品
