細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組的復(fù)雜性給生物學(xué)家和化學(xué)家分析和理解許多單個(gè)RNA種類的動(dòng)力學(xué)，折疊和功能帶來(lái)了挑戰(zhàn)。用于分析生物聚合物的最重要的化學(xué)策略之一是開發(fā)選擇性和有效的化學(xué)功能化方法。這樣的方法可以實(shí)現(xiàn)成像，定量，結(jié)構(gòu)分析和固定化，這是生物學(xué)和醫(yī)學(xué)中所有必不可少的工具。盡管蛋白質(zhì)的選擇性化學(xué)功能化反應(yīng)的開發(fā)在幾十年中取得了長(zhǎng)足的進(jìn)步，但與RNA形成化學(xué)鍵的方法的開發(fā)仍處于早期階段。特別是在轉(zhuǎn)錄的RNA的內(nèi)部位點(diǎn)形成鍵的方法仍然非常有限或非選擇性。以DNA為模板的1,N6-腺苷腺苷衍生物的產(chǎn)生提供了一種位點(diǎn)特異性RNA標(biāo)記的方法，但需要密集的合成，延長(zhǎng)的時(shí)間和較長(zhǎng)的過(guò)程。重氮酮可用于與鏈中的無(wú)規(guī)磷酸鹽反應(yīng)；但是，在內(nèi)部位點(diǎn)會(huì)產(chǎn)生水解不穩(wěn)定的RNA磷酸三酯鍵。諸如補(bǔ)骨脂素之類的光交聯(lián)劑僅對(duì)折疊的RNA中的雙鏈區(qū)域具有選擇性，并且不用于特定功能化，而是用于結(jié)構(gòu)映射的產(chǎn)率較低。在胞嘧啶和腺嘌呤上發(fā)生反應(yīng)的堿基反應(yīng)劑（如二甲基硫酸鹽），在鳥嘌呤上發(fā)生反應(yīng)的茚三酮對(duì)未配對(duì)堿基的選擇性僅高于配對(duì)堿基，并阻止堿基配對(duì)。最后，許多在未配對(duì)核苷酸的2-OH基團(tuán)上形成鍵的?；噭┮驯粡V泛用于痕量產(chǎn)率的結(jié)構(gòu)作圖。然而，由于它們的低溶解度和非常高的反應(yīng)性，它們通常不適合高產(chǎn)率官能化。重要的是，對(duì)于這些基本隨機(jī)反應(yīng)中的任何一種，都沒(méi)有報(bào)道用于序列選擇或位點(diǎn)選擇反應(yīng)的方法。 美國(guó)斯坦福大學(xué)的Eric T. Kool教授于本月在J.Am.Chem.Soc.上發(fā)表了一篇題為“Site-selective RNA Functionalization via DNA-induced Structure”的研究論文。文章通過(guò)開發(fā)一種用于RNA的定點(diǎn)?；耐ㄓ貌呗詠?lái)解決2-OH修飾選擇性的問(wèn)題。 利用雙鏈結(jié)構(gòu)中RNA的低反應(yīng)性，利用互補(bǔ)的DNA寡核苷酸保護(hù)RNA中除所需反應(yīng)位點(diǎn)以外的所有反應(yīng)位，繼而誘導(dǎo)環(huán)上的RNA?；?/span>RAIL）的方法。文章顯示，可以通過(guò)適當(dāng)設(shè)計(jì)和廉價(jià)的輔助DNA誘導(dǎo)RNA中的反應(yīng)性缺口或環(huán)，從而在預(yù)定位點(diǎn)產(chǎn)生高產(chǎn)率的?；?。該方法具有序列選擇性，并且反應(yīng)以近核苷酸分辨率發(fā)生，并允許隨后的RNA標(biāo)記和控制。 作者認(rèn)為RAIL方法廣泛適用于許多RNA種類，并且可以為許多化學(xué)和生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室所用。 圖1 用于位點(diǎn)選擇性RNA?；?/span>RAIL方法的示意圖。 將目標(biāo)RNA（R）與一個(gè)或多個(gè)互補(bǔ)輔助DNA（H）孵育以保護(hù)大部分RNA，但在環(huán)（a）或缺口（b）中留下單個(gè)未配對(duì)的核苷酸。 然后，暴露的2-OH基團(tuán)可以與?；噭?/span>NAI-N3，選擇性地反應(yīng)，在去除輔助DNA后產(chǎn)生位點(diǎn)定義的功能化RNA。 注意，大于單個(gè)核苷酸的環(huán)和缺口也是可能的。 圖2 優(yōu)化輔助DNA免受隨機(jī)RNA?；谋Ｗo(hù)。 （a）具有完整DNA補(bǔ)體的單鏈RNA（ssRNA）和RNA-DNA雙鏈的?；疽鈭D。 （b）?；?/span>ssRNA（R）的MALDI-TOF質(zhì)譜圖，完全互補(bǔ)DNA（R / H）保護(hù)的RNA，兩端均帶有三個(gè)脫氧腺苷（R / Ho）和2-deoxy- 3-磷酸修飾的RNA，具有3a突出端的完全互補(bǔ)DNA保護(hù)（Rp / Ho）； 在MOPS緩沖液中與50 mM NAI-N3在37℃反應(yīng)4h。 （c）逆轉(zhuǎn)錄酶（RT）引物延伸的凝膠電泳分析顯示，由于受保護(hù)的RNA，除在中央C，U位點(diǎn)發(fā)生微量反應(yīng)外，一般都沒(méi)有終止位。 圖3 在DNA誘導(dǎo)的環(huán)上RNA?；谋碚?。 （a）示意圖顯示誘導(dǎo)的環(huán)RNA酰化的過(guò)程。 （b）DNA保護(hù)的RNA（Rp / Ho），DNA誘導(dǎo)的1nt凸起RNA（Rp / Ho-L1）和DNAPage誘導(dǎo)的3nt環(huán)RNA（Rp / Ho-L3）的MALDI-TOF質(zhì)譜與200 毫米NAIN3。 （c）與200 mM NAI-N3反應(yīng)的無(wú)環(huán)（R / Ho），1nt凸起（R / Ho-L1）和3nt環(huán)（R / Ho-L3）的RNA樣品的RT終止子的凝膠電泳分析。 凝膠中條帶的序列和位點(diǎn)如圖所示。 注意，RT終止（和相應(yīng)的條帶）出現(xiàn)在緊接?；瘹埢?/span>3的核苷酸處。 圖4 誘導(dǎo)缺口處RNA?；谋碚?。 （a）誘導(dǎo)間隙RNA酰化步驟的示意圖。 （b）對(duì)無(wú)間隙（R / Ho），缺口（R / Ho-N），1nt間隙（R / Ho-G1）和3nt間隙（R / Ho-G3）的RNA樣品進(jìn)行RT終止的凝膠電泳分析， 與200 mM NAI-N3反應(yīng)。 序列和位點(diǎn)如所示。 圖5 通過(guò)移動(dòng)39 mer RNA靶中環(huán)或缺口的位置來(lái)編程局部?；稽c(diǎn)。 如圖所示，對(duì)于在不同位置具有1nt凸起或缺口的樣品，RT終止的PAGE分析。 凝膠中移位帶的比對(duì)序列如圖所示。 注意，RT終止（和相應(yīng)的條帶）出現(xiàn)在緊接反應(yīng)位置3的核苷酸處。 圖6 用于串聯(lián)核酶的現(xiàn)場(chǎng)選擇性可編程控制的RAIL方法。 （a）具有兩個(gè)催化核心（3TR，5TR）和兩個(gè)雙重標(biāo)記的3S底物（3TR），5S（5TR）的串聯(lián)核酶的序列； 下面通過(guò)RAIL方法顯示TR的選擇性?；玫?/span>3TR?；暮嗣负?/span>5TR?；暮嗣?。 （b）RAIL方法的機(jī)制可實(shí)現(xiàn)對(duì)串聯(lián)核酶的位點(diǎn)選擇性控制。 （c）顯示相對(duì)于未反應(yīng)的TR（標(biāo)準(zhǔn)化為1.0）的每種底物（3S和5S）裂解的相對(duì)初始速率的圖。 圖7 連續(xù)RAIL方法對(duì)65nt小核仁RNA（SNORD78）進(jìn)行雙重標(biāo)記，并通過(guò)FRET觀察折疊。 （a）SNORD78 RNA序列，帶有藍(lán)色標(biāo)記的標(biāo)記位點(diǎn)（帶有Alex488的G14；帶有TAMRA的A49）。 通過(guò)兩個(gè)連續(xù)反應(yīng)進(jìn)行RNA雙重標(biāo)記的過(guò)程示意圖。 （b）雙標(biāo)簽RNA凝膠分析的圖像； Alex488（綠色）和TAMRA（紅色）通道的疊加顯示兩種染料的重合。 （c）FRET信號(hào)響應(yīng)緩沖液相對(duì)于水的RNA結(jié)構(gòu)變化（供體在490 nm激發(fā)時(shí)發(fā)出熒光）。 在特定位點(diǎn)對(duì)RNA功能化的方法有很高的要求，但仍然是一個(gè)挑戰(zhàn)，特別是對(duì)于通過(guò)轉(zhuǎn)錄而不是通過(guò)全合成產(chǎn)生的RNA。最近的研究已經(jīng)描述了?；溥蛟噭?，該試劑在非堿基配對(duì)的區(qū)域中以2-OH基團(tuán)的高產(chǎn)率隨機(jī)反應(yīng)，覆蓋了分散的?；ブ械脑S多RNA。如果可能的話，局部反應(yīng)可能會(huì)在許多應(yīng)用中證明是有用的，可以在生物聚合物的特定位點(diǎn)和序列上提供功能性處理。在這篇文章里，作者描述了在定點(diǎn)的2-OH基團(tuán)上進(jìn)行RNA體外功能化的DNA定向策略。該方法稱為“誘導(dǎo)環(huán)RNA?；?/span>”（RAIL），它利用互補(bǔ)的輔助DNA寡核苷酸來(lái)暴露選定位置的缺口或環(huán)，同時(shí)保護(hù)DNA-RNA雙鏈體中的其余部分。然后進(jìn)行與酰基咪唑試劑的反應(yīng)，從而在預(yù)定位點(diǎn)提供高產(chǎn)率的2-OH共軛。實(shí)驗(yàn)揭示了最佳的輔助寡聚脫氧核苷酸設(shè)計(jì)和反應(yīng)條件，并對(duì)該方法進(jìn)行了測(cè)試，以控制局部核酶活性并用雙色熒光染料標(biāo)記RNA。 RAIL方法為可能進(jìn)行任何長(zhǎng)度和來(lái)源的RNA的位點(diǎn)選擇性標(biāo)記和控制提供了一種簡(jiǎn)單新穎的策略。 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c06824 埃里克·庫(kù)爾（Eric T. Kool）生于伊利諾伊州的利伯蒂維爾（Libertyville），并在俄亥俄州牛津的邁阿密大學(xué)完成了本科學(xué)習(xí)。他以哥倫比亞大學(xué)NSF研究員的身份繼續(xù)從事有機(jī)化學(xué)研究生的研究，并獲得了博士學(xué)位。 1988年，以NIH博士后研究員的身份繼續(xù)在Caltech接受培訓(xùn)。 1990年，他加入了羅切斯特大學(xué)（University of Rochester）的教職，并于1997年晉升為教授。1999年，他將實(shí)驗(yàn)室遷至斯坦福大學(xué)，在那里他是喬治·希爾達(dá)·道伯特（George and Hilda Daubert）化學(xué)教授。在斯坦福大學(xué)，他是Bio-X計(jì)劃（生物物理學(xué)計(jì)劃）的成員，并且是ChEM-H的會(huì)員。 Kool的研究興趣在于有機(jī)化學(xué)，化學(xué)生物學(xué)和生物物理學(xué)的跨學(xué)科領(lǐng)域。他的工作旨在設(shè)計(jì)新的功能上有用的分子工具，并將其應(yīng)用于對(duì)涉及核酸的生物相互作用和機(jī)理的基本了解。他最重要的貢獻(xiàn)之一是開發(fā)了稱為非極性核苷等位基因的DNA堿基模擬物，這使他的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)DNA復(fù)制可以在沒(méi)有Watson-Crick氫鍵的情況下發(fā)生。滾環(huán)擴(kuò)增（RCA）和滾環(huán)轉(zhuǎn)錄（RCT）的發(fā)明，它們是等溫DNA / RNA擴(kuò)增方法。設(shè)計(jì)的DNA堿基在活細(xì)胞中的首次成功應(yīng)用；從修飾的DNA開發(fā)許多熒光酶探針；以及用于成像和繪制細(xì)胞RNA結(jié)構(gòu)的分子探針的開發(fā)。迄今為止，已有超過(guò)275種出版物描述了Kool的工作，他在美國(guó)和國(guó)外舉辦了250多次受邀的演講。他的實(shí)驗(yàn)室分子工具已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了許多有用的應(yīng)用，并且他是30項(xiàng)已授予或正在申請(qǐng)的專利的發(fā)明者。他的發(fā)明被用作三個(gè)不同生物技術(shù)公司的創(chuàng)始技術(shù)。庫(kù)爾因其研究而獲得了許多國(guó)家獎(jiǎng)項(xiàng)，包括德雷福斯基金會(huì)教師-學(xué)者獎(jiǎng)學(xué)金，阿爾弗雷德·P·斯隆基金會(huì)獎(jiǎng)學(xué)金，美國(guó)化學(xué)學(xué)會(huì)的亞瑟·C·科普學(xué)者獎(jiǎng)，ACS輝瑞獎(jiǎng)和ACS Breslow獎(jiǎng)。他還被任命為美國(guó)科學(xué)促進(jìn)協(xié)會(huì)會(huì)員。 Kool在其實(shí)驗(yàn)室中培訓(xùn)了120多名研究生和博士后研究人員；其中有三十多個(gè)已在全球擔(dān)任學(xué)術(shù)職務(wù)。他是斯坦福大學(xué)二年級(jí)有機(jī)化學(xué)的熱門老師，曾兩次獲得人文與科學(xué)學(xué)院院長(zhǎng)杰出教學(xué)獎(jiǎng)。 作者主頁(yè)：https://web.stanford.edu/group/kool/cgi-bin/wordpress/eric-t-kool/ 編輯：瓜西的向逆 審核：飛天貓的神經(jīng)刀
J.Am.Chem.Soc.: 通過(guò)dna誘導(dǎo)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)選擇性RNA功能化
化學(xué)試劑
新材料產(chǎn)品
