蛋白磷酸化是普遍存在的調(diào)節(jié)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的翻譯后修飾。其中蛋白激酶催化真核蛋白底物中含羥基絲氨酸，蘇氨酸和酪氨酸的磷酸化。蛋白激酶活性異常通常與包括癌癥在內(nèi)的疾病有關(guān)，因此是一類有效的藥物靶標(biāo)。表征激酶底物對(duì)于破譯激酶信號(hào)傳導(dǎo)的分子細(xì)節(jié)十分重要。但是激酶-底物相互作用的瞬時(shí)性質(zhì)使得表征激酶底物具有困難，因此需要發(fā)展新的方法來全映射正常和患病狀態(tài)下的細(xì)胞信號(hào)。近日，韋恩州立大學(xué)的Mary Kay H. Pflum課題組在《Angew. Chem. Int. Ed.》期刊上發(fā)表了題為“An Affinity-Based, Cysteine-Specific ATP Analog for Kinase-Catalyzed Crosslinking”的研究論文。在該研究中，作者報(bào)道了一種基于親和力的交聯(lián)ATP類似物ATP-甲基丙烯酰胺（ATP-MAc），其中包含一個(gè)半胱氨酸反應(yīng)性丙烯酰胺交聯(lián)基團(tuán)，可避免紫外線輻射和現(xiàn)有類似物的非特異性反應(yīng)性。在體外激酶測定法中，ATP-MAc充當(dāng)激酶的共底物，僅在活性位點(diǎn)共價(jià)交聯(lián)含有半胱氨酸的激酶。此外，ATP-MAc還能夠在細(xì)胞裂解物溶液中交聯(lián)細(xì)胞蛋白，具有基于細(xì)胞研究的相容性。
圖1、（A）ATP和γ-磷?；揎椀?/span>ATP類似物：ATP-芳基疊氮化物（ATP-ArN3）、ATP-二苯甲酮（ATP-BP）和ATP-甲基丙烯酰胺（ATP-MAc）的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B）識(shí)別激酶-底物對(duì)的化學(xué)方法通常將瞬時(shí)激酶-底物相互作用轉(zhuǎn)化為可以純化和表征的穩(wěn)定復(fù)合物。通過在通用的激酶共底物ATP的γ-磷酰基上修飾光交聯(lián)劑（如ATP-ArN3或ATP-BP）可以開發(fā)光交聯(lián)探針。在紫外線照射下，ATP-ArN3和ATP-BP以磷酸化依賴性方式將激酶共價(jià)連接至其底物，以促進(jìn)激酶底物對(duì)的富集和鑒定。盡管ATP-ArN3和ATP-BP具有廣泛的反應(yīng)性和可誘導(dǎo)活化等優(yōu)點(diǎn)，但存在非特異性交聯(lián)和由于紫外線照射產(chǎn)生不良生物學(xué)效應(yīng)等問題。（C）為了避免紫外線輻射，作者開發(fā)了基于親和力的交聯(lián)基團(tuán)—具有半胱氨酸反應(yīng)性的甲基丙烯酰胺交聯(lián)基團(tuán)ATP-MAc，當(dāng)ATP-MAc修飾的γ-磷?；晦D(zhuǎn)移到激酶底物上時(shí)，在激酶活性位點(diǎn)的半胱氨酸與甲基丙烯酰胺基團(tuán)之間的邁克爾加成將使激酶共價(jià)交聯(lián)到其底物上。ATP-Mac無需紫外線照射，具有生理?xiàng)l件相容性以及半胱氨酸的特異性靶向性。
圖2、（A）EGFR激酶結(jié)構(gòu)域（藍(lán)綠色）與ATP類似物活性構(gòu)象的晶體結(jié)構(gòu)（pdb 2GS6）。（B）ATP類似物的γ-磷?；cEGFR活性位點(diǎn)最接近的半胱氨酸殘基的硫之間的距離為8.4 ?。（使用PyMOL軟件，原子的顏色編碼為C =綠色，H =灰色，N =藍(lán)色，O =紅色，P =橙色，S =黃色。）
方案1、ATP-MAc 1和2的合成。通過將甲基丙烯酸酐與二胺4或5孵育以合成胺6或7。最終通過將胺6和7與ATP偶聯(lián)而獲得ATP-MAc 1和2。
圖3、（A）通過熒光標(biāo)記反應(yīng)測試ATP-MAc 1和2在激酶催化的標(biāo)記中的反應(yīng)性。將雙FITC-胱胺10與ATP-MAc 1或2、PKA激酶對(duì)髓磷脂堿性蛋白（MBP）底物進(jìn)行熒光標(biāo)記示意圖。（B）通過SDS-PAGE分離及可視化。在ATP-MAc 1和2均存在的情況下，MBP被PKA和雙FITC-胱胺10熒光標(biāo)記（泳道4和6），沒有PKA（泳道3和5）或帶有星形孢菌素（泛激酶抑制劑）的反應(yīng)未顯示熒光標(biāo)記（泳道7和8），證實(shí)了激酶的依賴性，表明，ATP-MAc 1和2是具備與甲基丙烯酰胺反應(yīng)性的激酶共底物。（C）通過量化磷酸化程度來評(píng)估ATP-MAc 1和2作為共底物的效率。將ATP，ATP-MAc 1或ATP-MAc 2與PKA和MPB一起孵育，然后用酸裂解γ-磷?；系募谆０沸揎?，以在所有反應(yīng)中生成相同的磷酸化產(chǎn)物。通過SDS-PAGE分離反應(yīng)混合物并進(jìn)行染色監(jiān)測MBP磷酸化的程度。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在所有反應(yīng)中均觀察到了磷酸化的MBP（第2、3和4道）。（D）通過對(duì)C中四個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的結(jié)果定量分析，相對(duì)于ATP（轉(zhuǎn)化率為100%），ATP-Mac1和ATP-MAc 2轉(zhuǎn)化率分別為68±9％和60％±9％。表明兩種ATP-MAc類似物均具有可接受的轉(zhuǎn)化效率。
圖4、使用表皮生長因子受體（A）EGFR、B成纖維細(xì)胞生長因子受體4（FGFR4）、兩種含半胱氨酸的激酶（C）PKA、（D）ERK2對(duì)ATP-MAc 1進(jìn)行測試，以評(píng)估交聯(lián)的相容性。箭頭表示EGFR（A），FGFR4（B），PKA（C）或ERK2和p53（D），方括號(hào)表示由于交聯(lián)而導(dǎo)致的更高分子量的復(fù)合物。用PD153035（PD）、星形孢菌素（ST）或厚樸素（MG）激酶抑制劑或碘乙酰胺（IA）處理激酶以使激酶半胱氨酸烷基化作為對(duì)照1。將二硫蘇糖醇（DT）與ATP-MAc 1預(yù)孵育以使甲基丙烯酰胺基團(tuán)失活作為對(duì)照2。EGFR和FGFR4控制與細(xì)胞增殖，分化，遷移和轉(zhuǎn)錄相關(guān)的關(guān)鍵信號(hào)通路。重要的是，EGFR和FGFR4會(huì)發(fā)生自磷酸化作用，并在ATP結(jié)合位點(diǎn)的鉸鏈結(jié)合區(qū)和富含甘氨酸的環(huán)區(qū)具有反應(yīng)性半胱氨酸，使它們易于與ATP-MAc進(jìn)行激酶催化的交聯(lián)。為了確認(rèn)交聯(lián)需要反應(yīng)性半胱氨酸，對(duì)活性位點(diǎn)不含反應(yīng)性半胱氨酸，但會(huì)發(fā)生自磷酸化作用的PKA激酶進(jìn)行了相應(yīng)測試。將EGFR，FGFR4和PKA與ATP-MAc 1分別孵育，然后在SDS-PAGE分離并用EGFR，FGFR4和PKA抗體顯像后觀察到交聯(lián)。對(duì)于EGFR（89 kDa）和FGFR4（65 kDa），僅在存在ATP-MAc的情況下觀察到高分子量交聯(lián)復(fù)合物對(duì)應(yīng)于二聚體（EGFR：178 kDa、 FGFR4：130 kDa）和三聚體（EGFR4：267 kDa、FGFR4：195 kDa）（A、B泳道5和1）。當(dāng)用EGFR選擇性抑制劑（A第2道）或FGFR4激酶抑制劑（B第2道）處理反應(yīng)時(shí)，交聯(lián)的復(fù)合物丟失，這與激酶依賴性一致。當(dāng)在交聯(lián)之前將激酶的半胱氨酸殘基用碘乙酰胺烷基化時(shí)（A、B，泳道3），或者將ATP-MAc與巰基二硫蘇糖醇一起孵育（A、B，泳道4）時(shí)，也沒有交聯(lián)的復(fù)合物，表明硫醇和丙烯酰胺官能團(tuán)是交聯(lián)所必需的。相反，在PKA中未觀察到更高分子量的交聯(lián)C，泳道5），這表明ATP-MAc 1僅使含半胱氨酸的激酶交聯(lián)。通過ERK2與其已知底物p53的交聯(lián)進(jìn)一步測試ATP-MAc 1。 ERK2是MAP激酶途徑中的下游激酶，與細(xì)胞分化，增殖和存活有關(guān)。與EGFR和FGFR4相比，ERK2中的活性位點(diǎn)半胱氨酸位于DFG區(qū)域，這將測試活性位點(diǎn)的半胱氨酸位置對(duì)交聯(lián)的影響。ATP-MAc1與重組ERK2（68 kDa）的孵育導(dǎo)致形成了高分子量復(fù)合物，對(duì)應(yīng)于ERK2二聚體（136 kDa）和三聚體（204 kDa）（D，泳道6），這一結(jié)果與EGFR和FGFR4相似。當(dāng)包含p53（80 kDa）時(shí)，在高分子量（≈284 kDa）交聯(lián)復(fù)合物中也觀察到p53（D，泳道7），這表明p53在寡聚后與ERK2交聯(lián)。在存在ERK激酶抑制劑厚樸素、碘乙酰胺和DTT的情況下，交聯(lián)作用降低（D，第3-5道），證明了交聯(lián)的激酶，半胱氨酸和丙烯酰胺依賴性。這些結(jié)果證實(shí)了ATP-MAc 1可以應(yīng)用于多種含半胱氨酸的激酶與底物交聯(lián)。（E）為了確認(rèn)ATP-MAc 1可以使復(fù)雜的裂解物混合物中的激酶-底物對(duì)交聯(lián)，用EGF刺激HeLa細(xì)胞激活EGFR激酶，將其裂解，然后與ATP-MAc 1孵育。在SDS-PAGE分離可視化，發(fā)現(xiàn)除了EGFR（175 KDa），還觀察到了高分子量交聯(lián)帶（E，泳道3），這可能是EGFR-EGFR、EGFR底物和EGFR激酶復(fù)合物的組合。在沒有EGF刺激或ATP-MAc（E，泳道1和2）或使用EGFR選擇性抑制劑PD153035（E，泳道4）的反應(yīng)中，交聯(lián)復(fù)合物的反應(yīng)減少，表明ATP-MAc在復(fù)雜細(xì)胞混合物中以激酶依賴性方式交聯(lián)激酶-底物對(duì)。作者開發(fā)了一種基于親和力的交聯(lián)ATP類似物ATP-MAc，通過充當(dāng)激酶的共底物，使激酶僅與活性位點(diǎn)半胱氨酸交聯(lián)，且在裂解液混合物中依賴于激酶進(jìn)行。這種半胱氨酸特異性交聯(lián)劑避免了現(xiàn)有的ATP-光交聯(lián)劑的紫外線需求和非特異性反應(yīng)。在未來
