引言
核蛋白的ADP核糖基化是DNA損傷修復途徑的重要特征。組蛋白是ADP核糖基化的主要靶點，在DNA損傷之后用單一的ADP核糖單位修飾絲氨酸。細胞對斷裂的DNA的第一反應之一是多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶Ⅰ（PARP1）。這種酶在DNA斷裂時激活，隨后PARP1調節(jié)染色質的結構和招募參與DNA修復的蛋白質。ADP-核糖化的生物學和臨床意義對調節(jié)細胞通路并描述其在DNA修復中的功能有著至關重要的意義。 成果簡介 近期，普林斯頓大學化學系教授Tom W. Muir在《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Synthesis of ADP-Ribosylated Histones Reveals Site-Specific Impacts on Chromatin Structure and Function”的研究論文。本研究開發(fā)了一種高效、模塊化的半合成路線，用化學的方法將全長的ADP-核糖基化的組蛋白錨定在絲氨酸殘基上。用修飾過后的組蛋白所產生的各種ADP-核糖基化的染色質底物，用于生物物理檢測。除此之外，在使用一組賴氨酸甲基轉移酶的生化實驗中，利用ADP-核糖基化的核小體揭示對組蛋白H3K9甲基化的環(huán)境依賴的抑制。這種設計有望促進關于組蛋白ADP-核糖基化在DNA損傷中的作用研究。 圖文解讀 圖1：響應DNA損傷，組蛋白變成單腺苷二磷酸核糖。組蛋白旁化因子1(HPF1)與PARP1結合是組蛋白H3和H2B上絲氨酸殘基的ADP核糖基化所必需的，聚糖水解酶(PARG)的作用是將最初的多-ADP-核糖化產物快速轉化成單-ADP-核糖化的組蛋白。這種修飾對染色質結構和功能的影響尚不清楚。 圖2：ADP-核糖基化染色質的合成。 （a）改進的“樹脂焦磷酸鹽”形成腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯，將聯氨連接物負載到三苯基樹脂上，整個合成過程得到高純度的腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯。（b）通過無痕天然化學連接的手段產生ADP-核糖基化的組蛋白。然后，通過自由基介導的半胱氨酸連接“SCAR”進行脫硫得到全長的腺苷二磷酸核糖化肽α-硫酯。（c，d）H2BS6ADPr和H3S10ADPr的ESI-MS表征，說明已經合成出H2BS6ADPr和H3S10ADPr。（e）天然聚丙烯酰胺凝膠電泳分析表明龐大的陰離子ADP-核糖部分沒有妨礙有效的單核糖體（MN）形成。（f）在鹽梯度透析和Mg2+誘導沉淀純化了12聚體陣列后，使用天然凝膠電泳對瓊脂糖-丙烯酰胺復合凝膠對ADP-核糖基化的12個單體的陣列分析以及在限制酶消化MN和用ARH3處理后的分析。該數據表明在用BstXI限制性酶消化陣列到MNs會產生預期的腺原糖化MNs。 圖3：ADP核糖基化對高階染色質結構的影響。（a）在存在或缺少1 mM的Mn2+的情況下的12-mer核心陣列的綜合沉降系數分布，例如沉積速度實驗和Van Holde-weischet全分界面擬合分析，H3ADPr陣列的類似于未經修飾的對照，但H2BADPr陣列在添加Mg2+后沉積速度明顯減慢可能是雙重改性的ADPr陣列的致密性差，在36S處沉積的結果。（b）Mg2+介導的各種陣列自締合，確定離心后溶液中剩余的材料百分比。離心后殘留在上清液中的物質減少，這反映在沉淀H3ADPr標記所需的更高的Mg2+濃度上。 圖4：ADP核糖基化對組蛋白甲基轉移酶活性的影響。（a）自顯影圖分析G9A介導的H3K9各種MN的甲基化。使用核心組蛋白的新型考馬斯亮藍染色作為MNS的加載控制。相比之下，H2BS6ADP-核糖基化本身并不影響G9a的活性。這表明，H3S10腺原糖基化對G9a活性的抑制作用發(fā)生在cis中，這可能是由于G9a無法接觸其靶賴氨酸所致。 （b）a圖中自動顯影的定量。（c-e）蛋白質印跡分析ADP核糖基化對MLL1、PRC2和NSD2的甲基轉移酶活性的影響。與G9a介導的H3K9甲基化相比，H3K4和H3K27的甲基化通過H3S10加成核糖甲基化而適度增加。這種效應可能與通過ADP-核糖基化調節(jié)H3末端動力學有關，因為H3末端修飾削弱了其與核小體DNA的結合。 總結與展望 綜上所述，本文開發(fā)了一種高效合成腺苷二磷酸核糖基化多肽α-硫酯的方法，使得通過蛋白質半合成生產天然全長腺苷核糖化組蛋白成為可能。利用ADP-核糖化的H2B和H3制備化學定義的ADP-核糖化的單核糖體和核小體陣列，用于各種生物物理和生化實驗。這些研究表明：(I)組蛋白單-ADP-核糖化足以阻止染色質壓實和組蛋白PTM沉積，(Ⅱ)ADP-核糖化的特定位點是決定這些效應的關鍵。本文揭示了組蛋白單-ADP-核糖化在DNA修復中的作用，也強調了ADP-核糖化染色質底物在探索這一獨特修飾的效果方面的價值。 作者簡介 Tom W. Muir 普林斯頓大學化學系教授 研究方向：生物醫(yī)學興趣的復雜系統(tǒng)的蛋白質功能的物理化學基礎。使用有機合成和物理化學工具結合分子遺傳學研究蛋白質功能。在一系列生物學問題的推動下，開發(fā)了通用的化學生物學方法，使蛋白質的共價結構能夠以類似于較小有機分子的控制水平進行操縱。 這些技術既可在體內也可在體外應用，允許插入非自然氨基酸、翻譯后修飾和同位素探針——特別是在蛋白質的任何位置。 文獻鏈接 https://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/jacs.1c05429 編輯：章振華 審核：田風玉 推送：袁燕燕
