引言
G4配體是能夠與G-四鏈體DNA(G4)緊密結(jié)合的小分子。在G4研究領(lǐng)域，大量的精力被用于篩選或合理的設(shè)計(jì)G4配體，故而，也發(fā)展了一系列被廣泛接受和常規(guī)實(shí)施的分析方法來(lái)評(píng)估它們?cè)隗w外與G4的相互作用特性，并將它們作為創(chuàng)新的化學(xué)生物學(xué)工具來(lái)調(diào)控涉及G4S的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)。與之相反的是，迄今為止，只有相當(dāng)少的破壞G4S穩(wěn)定的小分子被研究，盡管已經(jīng)認(rèn)識(shí)到，這種分子工具將在神經(jīng)生物學(xué)中有巨大的應(yīng)用，因?yàn)樵S多遺傳和年齡相關(guān)的疾病都是由G4S的過(guò)度代表引起的。造成這種情況的一個(gè)可能的因素是缺乏可靠的體外試驗(yàn)來(lái)評(píng)估化學(xué)物質(zhì)的G4展開特性。同時(shí)，由于尚未進(jìn)行深入的細(xì)胞研究，關(guān)于使用這些化學(xué)物質(zhì)作為解旋酶的替代品還沒(méi)有廣泛的共識(shí)。 成果簡(jiǎn)介 近日，勃艮第大學(xué)ICMUB分子化學(xué)研究所高級(jí)研究員David Monchaud在《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Identifying G?Quadruplex-DNA-Disrupting Small Molecules”的研究論文。作者開發(fā)了一種體外檢測(cè)方法，以可靠地識(shí)別能夠破壞G4S穩(wěn)定的分子。這一工作流程包括新設(shè)計(jì)的G4-unfold分析，以及一系列經(jīng)典的用于研究G4/配體相互作用的生物物理和生化技術(shù)(CD、UV?Vis、PAGE和FRET-熔化)，以及qPCR stop分析。 圖文解讀 圖1. 在G4-unfold實(shí)驗(yàn)中評(píng)估的屬于一系列卟啉的分子(TMPyP4, TEGPy, TPPS, TArPS, and TEGP)，G4穩(wěn)定劑(PhenDC3, PDS, and BRACO19)，三芳基吡啶(Terpy)、氮雜環(huán)番(1，5-BisNPO、2，6-BisNPO和2，7-BisNPN)和G-鉗類似物(PhpC和GuaC)。 圖2. (A)Mendoza, Bourdoncle等開發(fā)的解旋酶分析示意圖。(B)適用于評(píng)估小分子的G4不穩(wěn)定性質(zhì)的相關(guān)G4-展開試驗(yàn)示意圖。 圖3. (A)通過(guò)增加TMPyP4(左)和PhpC(右)的量(1~20 mol當(dāng)量)進(jìn)行的G4-unfold分析獲得的實(shí)驗(yàn)曲線。(插圖)對(duì)應(yīng)的規(guī)格化曲線。小分子的存在既影響動(dòng)力學(xué)(由圖3A中C-hTelo添加后的曲線斜率表示)，也影響雜交的熱力學(xué)(由最終熒光水平表示)。(B)用14種配體在4種不同濃度(1~20 mol當(dāng)量，下進(jìn)行G4-unfold分析時(shí)，用原始數(shù)據(jù)(左圖)或歸一化數(shù)據(jù)(右圖)獲得平均初始速度值(V0，in s?1)的熱圖；趨于暗紅色的值高于對(duì)照(V0=51.5 s?1)，趨于深青色的值低于對(duì)照值。從原始數(shù)據(jù)(左圖)和歸一化數(shù)據(jù)(右圖)清楚地區(qū)分了小分子對(duì)于G4不穩(wěn)定(紅色)和G4穩(wěn)定(青色)的作用。 圖4. 隨著6種化合物(TMPyP4，TPPS，PhenDC3，1,5-BisNPO，2,7-BisNPN和PhpC)量(0~10 mol當(dāng)量)的增加，3 μM hTelo G4的CD(A)和UV?Vis滴定曲線以及CD和UV?Vis滴定中觀察到的變化隨著6種化合物含量的增加而變化的總結(jié)。 圖5. (A)hTelo和6種化合物(TMPyP4、TPPS、PhenDC3、1，5-BisNPO、2，7-BisNPN和PhpC)的不同的量(0~20 mol當(dāng)量)進(jìn)行PAGE實(shí)驗(yàn)的結(jié)果定量。(B)F21T和增加6種化合物的加入量(0~10 mol當(dāng)量)進(jìn)行的FRET熔融實(shí)驗(yàn)結(jié)果。隨著6種化合物含量的增加，PAGE和FRET熔融分析中觀察到的變化總結(jié)?？傊陨弦幌盗械捏w外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，這些技術(shù)中的每一種都提供了被測(cè)試化合物與G4相互作用特性的不同數(shù)據(jù)，但不能單獨(dú)使用和信任。其中PhpC通過(guò)了所有測(cè)試，被證實(shí)具有G4展開作用。 圖6. (A)由Sabouri等人開發(fā)的qPCR停止試驗(yàn)的示意圖。(B和C)在含有G4的鏈(B)或不含G4的對(duì)照鏈(C)的情況下，通過(guò)增加PhenDC3和PhpC的量(1~5 mol當(dāng)量)進(jìn)行qPCR停止分析研究的實(shí)驗(yàn)曲線。實(shí)驗(yàn)證明增加PhenDC3的量降低了G4鏈的擴(kuò)增效率，而PhpC被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)擴(kuò)增。(D和E)用1~5 mol當(dāng)量的TMPyP4、TPPS、PhenDC3、PDS和PhpC在含有G4的鏈(D)和不含G4鏈但含有對(duì)照鏈(E)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及隨著5種化合物含量的增加，qPCR停止實(shí)驗(yàn)中觀察到的變化總結(jié)，證明了PhpC展開G4的能力。 總結(jié)與展望 綜上所述，作者證明了卟啉作為DNA相互作用支架的多功能性，通過(guò)對(duì)它們的化學(xué)核心(電荷和側(cè)臂)的修飾，可以逆轉(zhuǎn)它們的結(jié)合特性。它在體外能夠有效地破壞G4結(jié)構(gòu)，促進(jìn)G4解旋酶的活性。除此之外，他們證明了一種結(jié)合不同技術(shù)(G4-unfold、CD、UV-Vis、PAGE、DLS、FRET-熔化、G4-解旋酶分析和qPCR停止分析)的多步驟方法的可靠性，以最可靠的方式評(píng)估可能的G4解離化合物的實(shí)際效率。這些技術(shù)是互補(bǔ)的，因?yàn)樗鼈兊墓逃袃?yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)可以相互補(bǔ)充。 作者簡(jiǎn)介 David Monchaud 勃艮第大學(xué)ICMUB分子化學(xué)研究所高級(jí)研究員。 研究方向：化學(xué)生物學(xué)，分子成像，光物理學(xué)，合成化學(xué)。 文獻(xiàn)鏈接 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c04426 編輯：趙曉蕊 審核：楊思慧 推送：鐘彩君
