引言
核酸定點(diǎn)切割工具的研究日益受到人們的關(guān)注。尤其是最近出現(xiàn)的與位點(diǎn)特異性斷裂密切相關(guān)的可正交激活DNA器件?，F(xiàn)有的切割策略大多是基于外源輔助，如激光照射。內(nèi)源性策略是正交可調(diào)節(jié)DNA機(jī)器探索關(guān)鍵的細(xì)胞內(nèi)生物過(guò)程和細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的非常理想的策略。 成果簡(jiǎn)介 近日，清華大學(xué)的張新榮課題組在《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了題為“Site-Specific Scissors Based on Myeloperoxidase for Phosphorothioate DNA”的研究論文。文中，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了用髓過(guò)氧化物酶(MPO)對(duì)硫代磷酸(PT)修飾的DNA進(jìn)行精確的位點(diǎn)特異性切割反應(yīng)，揭示了MPO通過(guò)氯化物氧化破壞PT修飾的剪刀式機(jī)理。此外，該團(tuán)隊(duì)還成功地將該剪刀用于激活PT修飾的發(fā)夾DNA機(jī)器，以產(chǎn)生類(lèi)似辣根過(guò)氧化物(HRP) 模擬 DNAzyme 或引發(fā)雜交鏈反應(yīng) (HCR) 擴(kuò)增。由于MPO在與細(xì)胞氧化應(yīng)激相關(guān)的通路中發(fā)揮著重要作用，因此通過(guò)該工具箱激活的HCR放大，使得活細(xì)胞中的氧化應(yīng)激得到了穩(wěn)健的成像。這項(xiàng)工作提出了一種精確的內(nèi)源性位點(diǎn)特異性切割工具，用于生物刺激的研究和 DNA 分子裝置的構(gòu)建。 圖文解讀 圖1 基于MPO的PT修飾dsDNA的分子剪刀。(A)?(E)剪刀在不同反應(yīng)條件下與PT改性dsDNA-BF相互作用的示意圖：(A)與MPO(10 μg/mL)、H2O2(100 μM)和Cl?(150 mM)相互作用；(B)不含H2O2；(C)不含MPO；(D)不含Cl?；(E)僅含PT改性dsDNA-BF。當(dāng)剪刀破壞PT修飾時(shí)，dsDNA-BF的熒光團(tuán)和猝滅劑會(huì)相互遠(yuǎn)離，熒光信號(hào)增強(qiáng)。 圖2 MHC剪刀切割PT改性DNA的機(jī)理研究。(A) oligo-random-PT底物位點(diǎn)特異性切割的變性PAGE表征。最左邊的泳道：Marker。通道1和通道2：裂解反應(yīng)的理論產(chǎn)物。通道3：未經(jīng)PT修飾的基質(zhì)，帶MHC剪刀。通道4?6：MHC剪刀切割底物，加入不同濃度的MPO(通道4：10 μg/mL；通道5：4 μg/mL；通道6：0 μg/mL)。(B)PT修飾的MHC剪刀切割dsDNA-BF的實(shí)時(shí)熒光光譜。F和F0分別代表有無(wú)MPO的熒光強(qiáng)度(MPO：10 μg/mL，H2O2：100 μM，Cl?：150 mM)。(C)AZD5904體外抑制MHC剪刀的熒光光譜。(D)AZD5904抑制劑的劑量依賴(lài)性抑制曲線(抑制劑濃度：0，500 nM，1 μM，5 μM，10 μM，50 μM，500 μM)。(E)切割反應(yīng)對(duì)不同濃度H2O2(0、10 NM、100 NM、1μM、10μM、100μM和1 mM)的熒光反應(yīng)。(F)不同濃度Cl?(0、1 mM、5 mM、10 mM、20 mM、50 mM、100 mM、150 mM和200 mM)對(duì)切割反應(yīng)的熒光響應(yīng)。在(B)?(F)中，PT修飾的雙鏈DNA-BF是反應(yīng)底物。誤差條是三個(gè)平行測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 圖3 (A) MHC激活的HRP模擬DNAzyme通過(guò)ptG4-發(fā)夾的位點(diǎn)特異性斷裂的示意圖。 (B)用不同條件處理的H2O2氧化的TMB的紫外-可見(jiàn)光譜和比色結(jié)果。紅線：(a) MPO：5 μg/mL，H2O2：100 μM，Cl?：150 mM，ptG4-發(fā)夾DNA：500 nM。藍(lán)線：(b)僅 ptG4-發(fā)夾DNA。橙色線：(c)沒(méi)有ptG4-發(fā)夾。綠線：(d)既沒(méi)有hDNA也沒(méi)有MHC剪刀。 (C) 黑色空心點(diǎn)代表MHC剪刀激活hemin/G-quadruplex-DNAzyme機(jī)器與不同濃度ptG4-發(fā)夾(1 nM, 2 nM, 4 nM, 6 nM, 8 nM, 10 nM, 20 nM、40 nM、60 nM、80 nM、100 nM、200 nM、500 nM 和 800 nM）。紫色空心圓點(diǎn)代表沒(méi)有MPO的陰性組。 (D)和 (E) MHC剪刀切割不同PT修飾的發(fā)夾DNA（改變 PT 修飾位置和數(shù)量）的效果比較。 (F) MHC剪刀用不同的G4-DNAzyme序列破壞發(fā)夾DNA。Amixis是裂解反應(yīng)后TMB氧化的OD值，AB-G4代表沒(méi)有MPO的對(duì)照組。誤差棒是三個(gè)平行測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 圖 4 (A) MHC剪刀激活的HCR反應(yīng)示意圖。 (B)傳統(tǒng)I0啟動(dòng)HCR和MHC激活HCR的瓊脂糖凝膠電泳表征。 “+ ”和“-”分別代表相應(yīng)成分的存在和不存在。(C) ptHCR-發(fā)夾響應(yīng)不同濃度MPO（0、25 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、625 ng/mL、1.25 μg/mL和2.5 μg/mL的熒光光譜）。 (D)熒光強(qiáng)度與MPO濃度（0、25 ng/mL、50 ng/mL、250 ng/mL、625 ng/mL、1.25 μg/mL 和 2.5 μg/mL）的校準(zhǔn)曲線。 (E)由各種干擾激活的HCR擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)化熒光結(jié)果。GSSG：5 mM；PMA：10 μg/mL；LPS：10 μg/mL；其他 ROS：100 μM。所有這些都與MHC剪刀組進(jìn)行了比較。 *** P < 0.001由t 檢驗(yàn)確定。誤差棒為三個(gè)平行測(cè)量的標(biāo)準(zhǔn)偏差。 圖5 (A) 在外部刺激下細(xì)胞內(nèi)MHC-HCR擴(kuò)增示意圖。 (B)巨噬細(xì)胞RAW264.7由刺激引發(fā)HCR的CLSM成像：(a)陰性組：無(wú)外部刺激；(b)用H2O2 (100 μM)預(yù)處理；(c)經(jīng) MPO(10 μg/mL) 和 H2O2 (100 μM)（MHC系統(tǒng)）預(yù)處理；(d)用 ClO-(10 μM) 預(yù)處理； (e) 經(jīng)PMA (4 μg/mL)預(yù)處理； (f) LPS (8 μg/mL)預(yù)處理。綠色通道是HCR的放大響應(yīng)(ex: 488 nm, em: 525 nm)，細(xì)胞核被Hoechst 33258染色（藍(lán)色通道，ex：346 nm，em：460 nm）。(C) 和 (D) 為在不同條件下對(duì)細(xì)胞樣品進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)計(jì)數(shù)的平均熒光強(qiáng)度 (MFI) 約為10000個(gè)活細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，誤差棒表示標(biāo)準(zhǔn)差。Ns 無(wú)顯著差異。***P < 0.001和****P < 0.0001由t 檢驗(yàn)確定。 圖6 LPS 刺激下，RAW264.7細(xì)胞中MHC-HCR擴(kuò)增的CLSM實(shí)時(shí)成像。 (A) 將細(xì)胞與LPS(8 μg/mL) 從0 分鐘到2小時(shí)30分鐘的孵育。LPS刺激60分鐘后將商業(yè) ROS染料（ex：594 nm，em：618 nm）混合到細(xì)胞中。(B) DHE和HCR擴(kuò)增在不同時(shí)間的平均熒光值。 (C) 有無(wú)LPS刺激的條件下，不同時(shí)間的MHC剪刀激活對(duì)HCR 擴(kuò)增的結(jié)果比較。 *** P < 0.001由t 檢驗(yàn)確定。 總結(jié)與展望 本文首次研究了髓過(guò)氧化物酶對(duì)硫代磷酸酯修飾的剪切反應(yīng)，成功地使用剪刀系統(tǒng)來(lái)控制功能性DNA片段從發(fā)夾結(jié)構(gòu)中的釋放。對(duì)ptG4-HCR進(jìn)行定點(diǎn)修飾后，產(chǎn)物自發(fā)轉(zhuǎn)化為hemin/G-quadruplex-DNAzyme機(jī)器，可有效提高系統(tǒng)的氧化能力。同時(shí)，ptHCR-發(fā)夾的存在提供了觸發(fā)HCR擴(kuò)增以選擇性地響應(yīng)MPO的可能，總而言之，活細(xì)胞氧化應(yīng)激途徑的實(shí)時(shí)成像已經(jīng)取得了成果。此外，PT是細(xì)菌中一種獨(dú)特的表觀遺傳修飾，其對(duì)細(xì)菌和宿主的氧化應(yīng)激研究很少，而這項(xiàng)工作為研究PT修飾在細(xì)菌和宿主中的拮抗作用提供了新思路。 團(tuán)隊(duì)簡(jiǎn)介 張新榮教授，清華大學(xué)化學(xué)系（分析中心）教授，博士生導(dǎo)師。該課題組的研究方向是分析化學(xué)。研究重點(diǎn)為光譜和質(zhì)譜儀器、分析方法及其在生命科學(xué)中的應(yīng)用。 課題組主頁(yè)：www.xrzhanggroup.com 文獻(xiàn)鏈接 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c06370 編輯：陳慧芳 審核：楊思慧 推送：鐘彩君
