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N⁶-甲基腺苷(m⁶A)修飾是哺乳動(dòng)物mRNA主要的修飾方式，其是由脫甲基酶和甲基轉(zhuǎn)移酶調(diào)控的動(dòng)態(tài)過(guò)程，在基因調(diào)控中起著至關(guān)重要的作用，包括調(diào)控mRNA的翻譯效率、穩(wěn)定性和剪接。m⁶A修飾在mRNA特定位點(diǎn)的改變與多種疾病相關(guān)，如癌癥、心血管疾病和神經(jīng)系統(tǒng)疾病。然而，由于技術(shù)限制，m⁶A功能的探索仍然具有挑戰(zhàn)性，無(wú)法獲得有關(guān)m⁶A修飾的基礎(chǔ)和空間信息。在細(xì)胞和空間異質(zhì)性方面，單細(xì)胞水平上可視化和量化m⁶A RNA的能力對(duì)于理解翻譯后調(diào)節(jié)和解決m⁶A甲基化相關(guān)疾病至關(guān)重要。

近日，清華大學(xué)李景虹教授在《Angew. Chem. Int. Ed.》發(fā)表了題為“Single-cell Imaging of m⁶A modified RNA Using m⁶A-specific In Situ Hybridization mediated Proximity Ligation Assay (m⁶AISH-PLA)”的研究論文。該研究提出了一種m⁶A特異性原位雜交介導(dǎo)的鄰近連接分析（m⁶AISH PLA），用于m⁶A RNA的細(xì)胞成像，允許識(shí)別RNA中特定位置的m⁶A修飾，并能夠在單細(xì)胞和單分子分辨率水平下對(duì)m⁶A RNA進(jìn)行成像。利用m⁶AISH PLA，研究了熱休克應(yīng)激下HSP70 RNA103-m⁶A的含量和亞細(xì)胞水平位置，發(fā)現(xiàn)熱休克下m⁶A修飾率增加，在細(xì)胞質(zhì)中的含量增加。m⁶AISH PLA可用于研究單個(gè)細(xì)胞中的m⁶ARNA，以破譯外轉(zhuǎn)錄組學(xué)機(jī)制并輔助臨床診斷。

圖1 A） 基于MB的用于檢測(cè)m⁶A RNA的m⁶AISH PLA示意圖。B） 影響m⁶AISH PLA效率的鄰近探針的配置。C） 實(shí)驗(yàn)中使用了鄰近探針的結(jié)合位點(diǎn)。鄰近探針的設(shè)計(jì)分別為N⁶腺苷的0nt、5nt、10nt、15nt、20nt、25nt。D）在（C）中不同鄰近探針對(duì)基于MB的m⁶AISH PLA的熒光響應(yīng)。E） mRNA序列的特異性以及與未修飾腺苷（A）去分m⁶A。PLA探針和phi29聚合酶的濃度分別為10 nM和0.25 U/μL。因此，這是一種高度敏感的分析方法，可用于定量RNA中特定位置的m⁶A修飾。

圖2 m⁶AISH PLA用于單細(xì)胞中m⁶A RNA的原位成像。(A) HSP70 RNA103-m⁶A在Hepa1-6細(xì)胞中通過(guò)m⁶AISH PLA顯示的熒光圖像示例。亮綠色點(diǎn)表示HSP70 RNA103-m⁶A的擴(kuò)增子，細(xì)胞核顯示為灰色（DAPI），細(xì)胞輪廓用灰色虛線(xiàn)標(biāo)記。標(biāo)尺：10μm。每個(gè)單元放大器的頻率直方圖顯示在底部（單元編號(hào)≥100)。 (B)熱儲(chǔ)存前后單個(gè)細(xì)胞中HSP70 RNA103-m⁶A和HSP70 mRNA拷貝數(shù)的直方圖(C)熱儲(chǔ)存前后HSP70 RNA103-m⁶A和HSP70 mRNA平均表達(dá)的量化。與現(xiàn)有方法相比，m⁶AISH-PLA不僅可以在單細(xì)胞水平上精確定量m⁶A修飾的RNA，而且可以提供修飾程度和細(xì)胞異質(zhì)性水平的信息。

圖3 在Hepa1-6細(xì)胞中定位HSP70 RNA103-m⁶A的空間模式。(A)提取特征以描述單個(gè)細(xì)胞中擴(kuò)增子的定位。(B)熱休克前后HSP70 RNA103-m⁶A到細(xì)胞質(zhì)心的平均距離的量化。(C)定量分析細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中HSP70 RNA103-m⁶A的百分比。(D)熱休克時(shí)m⁶A RNA表達(dá)的示意圖。結(jié)果表明m⁶A甲基化與mRNA的空間分布在功能上相關(guān)。

在本研究中，提出了一種m⁶A特異性原位雜交介導(dǎo)的鄰近連接分析（m⁶AISH PLA），用于m⁶A RNA的細(xì)胞成像，允許識(shí)別RNA中特定位置的m⁶A修飾，并能夠在單細(xì)胞和單分子分辨率水平下對(duì)m⁶A RNA進(jìn)行成像。雖然m⁶AISH PLA的吞吐量相對(duì)較低，并且由于PLA在物理距離上的限制，無(wú)法在短序列范圍內(nèi)區(qū)分m⁶A位點(diǎn)，但它與現(xiàn)有技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)：（1）m⁶AISH PLA可以通過(guò)m⁶A修飾和RNA序列的兩個(gè)識(shí)別事件在mRNA的特定位置識(shí)別m⁶A；（2）m⁶AISH PLA的等溫和溫和條件有助于保存細(xì)胞結(jié)構(gòu)和形態(tài)，并有可能分析組織中m⁶A修飾的RNA；（3）一靶一擴(kuò)增子擴(kuò)增使我們能夠以單分子分辨率定量m6A RNA，從而提供準(zhǔn)確的空間和定量測(cè)量。m⁶AISH PLA可用于研究細(xì)胞間的變異和空間格局，并有望破譯轉(zhuǎn)錄后功能和涉及不同細(xì)胞過(guò)程和疾病發(fā)生的翻譯控制機(jī)制。在未來(lái)，可以使用熒光量子點(diǎn)實(shí)現(xiàn)m⁶AISH PLA的復(fù)用能力，并且使用超分辨率熒光成像提高空間分辨率將有助于識(shí)別RNA序列中位置較近的m⁶A。

李景虹，中國(guó)科學(xué)院院士，清華大學(xué)化學(xué)系教授，化學(xué)系學(xué)術(shù)委員會(huì)主任，清華大學(xué)分析中心主任，分析化學(xué)所所長(zhǎng)，教育部長(zhǎng)江特聘教授，國(guó)家杰出青年基金獲得者，基金委創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)負(fù)責(zé)人、英國(guó)皇家化學(xué)會(huì)會(huì)士。近年來(lái)致力于電分析化學(xué)、生物電化學(xué)、單細(xì)胞分析化學(xué)、納米電化學(xué)及能源環(huán)境電化學(xué)等領(lǐng)域的教學(xué)科研工作。

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/anie.202109118

編輯：馮燦

審核：楊思慧

推送：鐘彩君