所有活生物體都有磷脂膜來控制物質(zhì)與細(xì)胞外基質(zhì)的交換，這能夠分離并保護(hù)敏感的化學(xué)反應(yīng)，并維持細(xì)胞內(nèi)部的平衡。此外，細(xì)胞需要磷脂來參與能量產(chǎn)生、膜蛋白合成和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。磷脂通常是由膜結(jié)合的酰基轉(zhuǎn)移酶酶促生成的，是肯尼迪脂質(zhì)合成途徑的一部分。這些生化反應(yīng)所需的脂肪酸又由脂肪酸合酶（FAS）制成。FAS是普遍存在的蛋白質(zhì)，通過酶促功能的模塊化和使用載體介導(dǎo)的底物穿梭，以高效的方式催化脂肪酸的合成。從磷脂合成的生化途徑中汲取靈感，已有研究設(shè)計(jì)了自下而上構(gòu)建磷脂膜的策略。盡管最近的研究表明，磷脂可以通過化學(xué)偶聯(lián)反應(yīng)以非生物的方式生成，但烷基鏈通常是外部預(yù)先合成的。當(dāng)前，尚無已知的仿生策略能通過原位形成的脂肪酸尾巴與單鏈兩親物偶聯(lián)從頭合成磷脂。
加州大學(xué)圣地亞哥分校的Michael D. Burkart教授和Neal K. Devaraj教授近日在J. Am. Chem. Soc.上共同發(fā)表了一篇題為“Chemoenzymatic Generation of Phospholipid Membranes Mediated by Type I Fatty Acid Synthase”的研究論文。在這項(xiàng)工作中，作者采用細(xì)菌I型FAS（cgFAS I）結(jié)合天然化學(xué)連接（NCL），從簡(jiǎn)單的水溶性脂肪酸前體自發(fā)生成膜形成合成磷脂（圖1）。這一種化學(xué)酶法可以從頭開始形成膜，即在無預(yù)先存在的膜的情況下形成膜?；瘜W(xué)酶促磷脂的形成可提供更簡(jiǎn)單的策略，以在合成細(xì)胞中產(chǎn)生膜區(qū)室，支持重組膜蛋白的方法的發(fā)展，并促進(jìn)天然和非規(guī)范脂質(zhì)的合成。 圖1 FAS介導(dǎo)的化學(xué)酶促磷脂合成的示意圖。細(xì)菌I型FAS使用乙酰基-CoA，丙二酰-CoA和NADPH原位合成棕櫚酰-CoA 1。隨后通過天然化學(xué)連接（NCL）與半胱氨酸修飾的溶血磷脂2反應(yīng)形成磷脂3，其自發(fā)地自組裝成膜結(jié)合的囊泡。 圖2 由細(xì)菌I型FAS（cgFAS）介導(dǎo)的棕櫚酰-CoA 1的原位合成。作者首先為原位形成活化脂肪酸確定了合適的FAS。II 型FAS由多種酶協(xié)同作用組成，而I型FAS由具有催化結(jié)構(gòu)域的單個(gè)多酶復(fù)合物組成，它們相互協(xié)作以形成脂肪酸。I型FAS將乙酰輔酶A和丙二酰輔酶A以化學(xué)計(jì)量形式產(chǎn)生中鏈脂肪酸（圖2A）。圖2A為迭代脂肪酸延伸周期的示意圖。丙二?；?棕櫚酰基轉(zhuǎn)移酶（MPT）將最終的棕櫚?；糠洲D(zhuǎn)移至CoA分子以形成1[AT：?；D(zhuǎn)移酶；ACP：酰基載體蛋白；KS：酮合酶；KR：酮還原酶；DH：脫水酶；ER：烯酰還原酶]。N端His 6標(biāo)記的I型cgFAS在大腸桿菌中表達(dá)，并通過采用先前報(bào)道的程序進(jìn)行純化。使用快速蛋白質(zhì)液相色譜（FPLC）色譜柱上的尺寸排阻色譜（SEC）驗(yàn)證了蛋白質(zhì)的完整性及其寡聚狀態(tài)（圖2B）。然后對(duì)這些餾分進(jìn)行煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）消耗測(cè)定，以驗(yàn)證cgFAS活性（圖2C）。與以前的報(bào)告一致，觀察到棕櫚酰輔酶A 1是cgFAS催化反應(yīng)的主要產(chǎn)物。脂肪酸甲酯（FAME）形成后，使用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)（圖2D），觀察到1占形成的總脂肪酸種類的93％。 圖3 為了確定非經(jīng)典磷脂3形成膜結(jié)合囊泡的能力，進(jìn)行了顯微鏡研究。棕櫚酰輔酶A 1和溶血磷脂2均未在水溶液中形成膜。水合時(shí)，磷脂3易于形成膜結(jié)合的組件（圖3）。最初通過相差（圖3A）和熒光顯微鏡使用膜染色染料BODIPY-FL DHPE（圖3B）鑒定脂質(zhì)囊泡。在磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）中，37°C下將3 水化和攪拌1 h后，觀察到直徑為1-10 μm的囊泡。透射電子顯微鏡（TEM）也證實(shí)了囊泡結(jié)構(gòu)的形成（圖3C）。通過在高極性熒光染料8-羥基-1,3,6-三磺酸（HPTS）存在下3的脂質(zhì)薄膜水合來證明磷脂囊泡的包封能力，然后通過使用熒光顯微鏡對(duì)囊泡進(jìn)行表征（圖3D）。 圖4 表征了各個(gè)酶和化學(xué)反應(yīng)的特征后，作者接下來探索了在一鍋法反應(yīng)中將酶促棕櫚酰-CoA 1合成與化學(xué)磷脂3合成相結(jié)合的過程（圖4）。簡(jiǎn)而言之，作者將溶血磷脂2（400 μM）添加到pH 7.4的10 mM磷酸鹽（Na2HPO4 / NaH2PO4）緩沖液中，其中含有cgFAS I（1 μM），乙酰-CoA（1 mM），丙二酰-CoA（1 mM），NADPH（10 mM）和=與TCEP（10 mM）。使用HPLC-MS-ELSD測(cè)量來跟蹤磷脂的形成。反應(yīng)條件的優(yōu)化使通過cgFAS I生成的1和2能夠快速偶聯(lián)。一鍋反應(yīng)在30分鐘內(nèi)提供了相應(yīng)的磷脂3作為主要產(chǎn)物（圖4A）。所有溶血磷脂2在不到4小時(shí)內(nèi)被消耗（圖4B），得到367 μM磷脂3。反應(yīng)30分鐘后，使用BODIPY-FL DHPE通過熒光顯微鏡檢測(cè)了小的囊泡結(jié)構(gòu)。使反應(yīng)在37°C攪拌過夜后，我們觀察到直徑在1-2μm的較大囊泡（圖4C）。通過BODIPY-FL DHPE的熒光顯微鏡觀察，在37°C下，囊泡在48小時(shí)內(nèi)是穩(wěn)定的(圖4D)。 本工作中，作者開發(fā)出一種化學(xué)酶法從水溶性前體合成非經(jīng)典磷脂。 這一方法可以靈活地使反應(yīng)中產(chǎn)生的脂質(zhì)種類多樣化。文中利用cgFAS I選擇性地生成棕櫚酰輔酶A，如果使用其他生物脂肪酸合酶也可以形成多種多樣的脂肪酰基輔酶A，隨后可以將其與反應(yīng)性溶血磷脂偶聯(lián)以產(chǎn)生多種種非經(jīng)典脂質(zhì)。例如，已知許多細(xì)菌中的FAS可以從支鏈的短鏈羧酸前體（如甲基丙二酰-CoA）合成末端支鏈的異構(gòu)、反異構(gòu)或ω-脂環(huán)族脂肪酸。作者希望利用各種磷脂物種的原位合成，以促進(jìn)對(duì)脂質(zhì)膜組成如何影響囊泡組裝、生長(zhǎng)和分裂的研究。 Michael D. Burkart 教授 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02121?ref=pdf
