引言
RNA世界假說假設(shè)在現(xiàn)代生物學(xué)公認(rèn)的DNA-RNA-蛋白質(zhì)中心法則出現(xiàn)之前，生命體的基本活動(dòng)完全基于RNA，RNA不僅可以作為遺傳信息的存儲(chǔ)器，同時(shí)還起到催化作用。盡管有多種證據(jù)支持RNA世界假說，并且近年來在核苷酸的益生元合成和RNA的非酶聚合方面取得了重大進(jìn)展，但是RNA是第一個(gè)還是唯一可能的遺傳聚合物仍值得商榷。因此，近年來不斷有學(xué)者致力于合成一系列具有類似潛力的核酸類似物，主要是對(duì)核苷酸天然糖基部分進(jìn)行各種化學(xué)修飾取代，并研究其堿基配對(duì)的特性。其中，蘇糖核酸（TNA）最吸引人關(guān)注，主要原因是它的糖環(huán)由蘇糖組成，蘇糖在地球益生元條件下可能比戊糖（如核糖）在空間上更容易接觸到，同時(shí)TNA遵循Watson-Crick堿基配對(duì)規(guī)則，并且能夠與RNA及其自身的互補(bǔ)鏈形成反平行雙鏈體結(jié)構(gòu)，這為在系統(tǒng)內(nèi)傳遞遺傳信息提供了可能。因此對(duì)TNA的深入研究，將有助于我們深層次的認(rèn)識(shí)RNA世界假說。 成果簡(jiǎn)介 南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院于涵洋教授近日在《J. Am. Chem. Soc.》上發(fā)表了一篇題為“A Threose Nucleic Acid Enzyme with RNA Ligase Activity”的研究論文。在這項(xiàng)工作中，作者通過體外篩選的方法，確定了能夠催化2'，3'-二醇和5'-三磷酸基團(tuán)之間RNA連接反應(yīng)的TNA（Threose nucleic acid）酶序列。具有RNA連接酶活性的TNA酶的發(fā)現(xiàn)可能會(huì)成為一種新的分子生物學(xué)工具。 圖文解讀 圖1 體外篩選鑒定具有RNA連接酶活性的TNA酶。（A） TNA和RNA重復(fù)單元的化學(xué)結(jié)構(gòu)。（B）使用含有2'，3'-二醇和5'-三磷酸酯基團(tuán)的底物可能進(jìn)行的線性RNA連接反應(yīng)原理圖。（C）TNA酶T8-6催化RNA連接的電泳分析。（D）預(yù)測(cè)TNA酶T8-6和RNA底物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。 圖2驗(yàn)證TNA酶T8-6催化線性2'-5'RNA連接。（A）部分堿性水解實(shí)驗(yàn)表明，TNA酶T8-6催化的RNA連接產(chǎn)物是線性而不是分支結(jié)構(gòu)。（B）使用脫氧核酶8-17的切割試驗(yàn)表明，新形成的鍵不是天然的3'-5'鍵。（C）引入連接產(chǎn)物的互補(bǔ)cDNA鏈，導(dǎo)致脫氧核酶8-17無法在3'-5'進(jìn)行切割，進(jìn)一步驗(yàn)證了TNA酶T8-6連接的是2'-5'。 圖3 TNA酶T8-6催化反應(yīng)的生化特征。（A和B）在pH 9.0和7.5下（40 mM Mg2+），考察T8-6催化的RNA連接反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)。（C）pH依賴性的T8-6催化反應(yīng)速率常數(shù)。（D）T8-6催化的反應(yīng)產(chǎn)率（pH 9.0持續(xù)3h，pH 7.5持續(xù)6 h）對(duì)Mg2+濃度的依賴。（E）pH 7.5時(shí)，在各種二價(jià)金屬離子存在下，T8-6催化6h的RNA連接反應(yīng)的產(chǎn)率。（F）在pH 7.5下，T8-6催化6小時(shí)的反應(yīng)產(chǎn)率對(duì)Mn2+或Zn2+濃度的依賴性。（G）pH 7.5時(shí)，在5 mM Mn2+或1.25 mM Zn2+存在下T8-6催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)分析。這一實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象充分說明了T8-6 RNA連接酶對(duì)二價(jià)金屬離子的依賴性。 圖4 T8-6連接酶對(duì)底物序列要求。（A）測(cè)定了最后一個(gè)位置具有不同殘基的左側(cè)底物和第一個(gè)位置具有嘌呤的右側(cè)底物。（B）測(cè)定了在-2，+ 2和更遠(yuǎn)的位置具有不同殘基的RNA底物。（C）測(cè)定了在連接位點(diǎn)附近具有不變的UA | GA殘基并且在其他位置具有可變殘基的RNA底物。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明有效的反應(yīng)需要在連接處存在UA|GA殘基，并且可以容忍其他位置的變異。 圖5 具有2'-5'連接活性的錘頭狀核酸切割酶的制備和活性測(cè)定。（A）TNA酶T8-6和兩個(gè)RNA底物的二級(jí)結(jié)構(gòu)。（B）T8-6催化的連接反應(yīng)的分析，該反應(yīng)產(chǎn)生具有2'-5'鍵的錘頭狀核酸切割酶。（C）T8-6連接產(chǎn)生的的錘頭狀核酸切割酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)及其RNA底物示意圖。（D）錘頭狀核酶的RNA切割活性測(cè)定。通過上述實(shí)驗(yàn)可以證明，通過T8-6催化產(chǎn)生的2'-5'連接活性的錘頭狀核酸切割酶，可以保持對(duì)底物切割的活性。 總結(jié)與展望 在這項(xiàng)工作中，作者通過體外篩選的方法，旨在分離具有RNA連接酶活性的TNA序列，分離出來的T8-6 RNA連接酶可以用于構(gòu)建具有活性的錘頭狀核酸切割酶。鑒定此類催化性TNA將為TNA作為潛在的前RNA遺傳聚合物提供進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)支持，同時(shí)TNA可以作為RNA連接酶這一發(fā)現(xiàn)拓寬了分子生物學(xué)的應(yīng)用范圍，可以成為一種新的分子工具。 作者簡(jiǎn)介 于涵洋，南京大學(xué)現(xiàn)代工程與應(yīng)用科學(xué)學(xué)院教授，博士生導(dǎo)師 2007年，北京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院獲學(xué)士學(xué)位 2013年，美國(guó)亞利桑那州立大學(xué)獲博士學(xué)位 2013-2015年，美國(guó)耶魯大學(xué)做博士后訓(xùn)練 2015年，入選國(guó)家高層次人才計(jì)劃，加入南京大學(xué) 2018年，入選江蘇省雙創(chuàng)人才計(jì)劃 研究領(lǐng)域 課題組主要從事化學(xué)和生物學(xué)交叉學(xué)科方向的研究，以人工核酸為主要研究對(duì)象，開展化學(xué)生物學(xué)和合成生物學(xué)方面的研究工作。課題組發(fā)展的功能性非天然核酸，可以為腫瘤免疫治療、腫瘤靶向治療、解決抗生素耐藥性等重要問題，提供新型工具分子和干預(yù)手段 文獻(xiàn)鏈接 https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c02895
