今天為大家分享一篇發(fā)表在JACS上的“ Reprogramming of Protein-Targeted Small-Molecule Medicines to RNA by Ribonuclease Recruitment”文章，本文的通訊作者是來(lái)自美國(guó)加利福尼亞州化學(xué)斯克里普斯研究所的Matthew D. Disney教授。
引言 對(duì)已知藥物進(jìn)行重新編程，使其具有比傳統(tǒng)靶點(diǎn)更強(qiáng)的活性和選擇性的新靶點(diǎn)是具有挑戰(zhàn)性的。通過(guò)研究RNA褶皺與已知小分子藥物之間的結(jié)合作用，并挖掘人類RNA數(shù)據(jù)集，作者確定Dovitinib，一種受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，結(jié)合前體到microRNA-21 (pre-miR-21)。Dovitinib被合理地重新編程為pre-miR-21，利用它作為RNA識(shí)別元件，在一個(gè)嵌合化合物中，也招募RNase L誘導(dǎo)RNA的催化降解。通過(guò)增強(qiáng)固有的RNA靶向活性和降低對(duì)細(xì)胞中典型RTK蛋白靶點(diǎn)的作用，嵌合體將pre-miR-21的選擇性改變了2500倍，緩解了由miR-21過(guò)表達(dá)引起的三陰性乳腺癌和Alport綜合征小鼠模型的疾病進(jìn)展。因此，靶向降解可以顯著提高選擇性，甚至跨越不同的生物分子，例如，蛋白質(zhì)與RNA。 圖1： 通過(guò)識(shí)別RNA結(jié)合物對(duì)ReFRAME小分子庫(kù)進(jìn)行基于信息的重編程。（A）左：1024個(gè)成員的3*2 RNA內(nèi)部循環(huán)庫(kù)(3*2 ILL)的二級(jí)結(jié)構(gòu)并匯總了9300個(gè)成員的ReFRAME庫(kù)；右：文庫(kù)和文庫(kù)對(duì)比掃描探測(cè)了超過(guò)950萬(wàn)個(gè)RNA基序小分子相互作用的組合，以識(shí)別具有高親和力的小分子藥物結(jié)合的特殊RNA結(jié)構(gòu)。（B）Dovitinib，一種臨床使用的受體酪氨酸激酶(RTK)抑制劑，可能會(huì)對(duì)miR-21的前體(pre-miR-21)進(jìn)行重編程。miR-21與許多疾病相關(guān)。miRNA通過(guò)與信使RNA（mRNA）的3’UTR序列互補(bǔ)和空間阻斷核糖體組裝或者通過(guò)RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)核問(wèn)題（RISC）誘導(dǎo)剪切來(lái)抑制mRNA的翻譯。轉(zhuǎn)錄后，初始miRNAs（pri-miRNAs）通過(guò)核糖核酸酶Drosha處理為pre-miRNAS，運(yùn)輸至細(xì)胞質(zhì)后，通過(guò)核酶Dicer進(jìn)一步加工為成熟的miRNAs。Dovitinib能夠特異性結(jié)合至Dicer處理的pre-miR-21位點(diǎn)。 圖 2： （A）組分1,4和5的結(jié)構(gòu)。作者尋求一種策略來(lái)引導(dǎo)組分1活性和對(duì)pre-miR-21的選擇性，其中一種方法是靶向RNA降解。因此作者將組分1轉(zhuǎn)化為RNA降解物或靶向嵌合體的核糖核酸酶（4，RIBOTAC）或靶向嵌合體的蛋白水解酶（5，PROTAC）。（B）作者探究組分1是否抑制了RNA的生物發(fā)生及其下游的生物學(xué)功能。事實(shí)上，組分1抑制了TNBC細(xì)胞中pre-miR-21加工，與推測(cè)的作用模式一致，抑制Dicer加工，增加了pre-miR-21水平，但保持pri-miR-21水平不變。在MDA-MB-231細(xì)胞中，與1相比，4顯著增強(qiáng)了對(duì)pre-miR-21的選擇性和效力。特別是在5μM劑量下，1使成熟miR-21水平降低了30%，而4在0.2 μM劑量下觀察到類似的降低，效力增加了25倍。作者通過(guò)耦合泛素連接酶的招募體將1轉(zhuǎn)化為PROTAC 5，其能降低FLT3水平，增加pre-miR-21水平，其程度與1相似。（C）設(shè)計(jì)的RIBOTAC 4與pre-miR-21結(jié)合，招募并局部激活核糖核酸酶L (RNase L)來(lái)切割靶標(biāo)。（D）接下來(lái)作者進(jìn)行了一系列的實(shí)驗(yàn)來(lái)研究1，RIBOTAC 4和PROTAC 5是否在功能上抑制MDA-MB-231細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶和miR-21調(diào)節(jié)蛋白RTK和下游磷酸化。與1相比，PROTAC 5的RTK抑制增加了5倍，而RIBOTAC 4的RTK抑制減少了100倍?？傊?， 4對(duì)miR-21的抑制作用比1強(qiáng)25倍，對(duì)RTKs的功能抑制作用比1弱100倍 圖3：RIBOTAC 4選擇性抑制miR-21的原理。上圖為評(píng)估RIBOTAC 4如何選擇性抑制miR-21的實(shí)驗(yàn)流程圖。 圖4：接下來(lái)作者做一個(gè)整體性研究。1（1 μM,成熟miR-21水平不降低），4(1 μM,成熟miR-21水平降低45%),和一個(gè)靶向miR-21的寡核苷酸 (LNA-21 0.1 μM,成熟miR-21水平降低97%)。在MDA-MB-231細(xì)胞中，對(duì)所有三種化合物的蛋白質(zhì)組均觀察到適中的影響(檢測(cè)到2965種蛋白質(zhì)，受影響的比例小于或等于1.5%)，表明了選擇性。（D-F）通過(guò)量化分析這三種化合物對(duì)由miR-21調(diào)控的mRNA編碼的蛋白水平的影響，在4和LNA-21處理下，這些蛋白有顯著變化。然而1 μM的1處理對(duì)miR-21調(diào)控蛋白無(wú)影響，可能是影響RTK相關(guān)通路。 圖5：（A-C）作者進(jìn)一步研究了1 (1 μM)、4 (1 μM)和LNA-21 (0.1 μM)在MDA-MB-231細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄組效應(yīng)。在所有3個(gè)處理中普遍檢測(cè)到的3567個(gè)基因中，28%(1070/3567)受顯著影響，而4和LNA-21分別影響10.8%(387/3567)和11.8%(422/3567)。（D-F）類似地，比較每個(gè)可檢測(cè)到的轉(zhuǎn)錄本的折疊變化，發(fā)現(xiàn)用RIBOTAC 4和LNA-21處理的轉(zhuǎn)錄組范圍幾乎相同，這與1不同(圖5D F)。這些研究表明，在蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組范圍內(nèi)，4和LNA-21對(duì)pre-miR-21的選擇性比1更強(qiáng)，進(jìn)一步支持了RIBOTAC將選擇性轉(zhuǎn)移到RNA上。 圖6： 基于以上結(jié)果，作者研究了4s在異種移植小鼠模型（MDA-MB-231-Luc細(xì)胞）中抑制miR-21介導(dǎo)乳腺癌向肺轉(zhuǎn)移的能力。（A）通過(guò)藥物代謝和藥代動(dòng)力學(xué)(DMPK)分析，作者將RIBOTAC 4以一定劑量腹腔注射，達(dá)到肺內(nèi)1 μM的藥物暴露，這也表明該化合物在體內(nèi)是穩(wěn)定的。事實(shí)上，4治療抑制了乳腺癌的轉(zhuǎn)移停滯，這可以從與給藥小鼠相比肺結(jié)節(jié)數(shù)量的減少得到證明。（B）肺組織學(xué)研究表明，治療也可減少蘇木精和伊紅染色。熒光原位雜交(FISH)顯示，4顯著降低了miR-21和pre-miR-21的表達(dá)，而免疫組化(IHC)顯示4抑制PDCD4的表達(dá)，而對(duì)ERK或pERK的水平?jīng)]有影響。從而證明了重編程Dovitinib-based RIBOTAC在體內(nèi)選擇性調(diào)節(jié)miR-21水平的能力。值得注意的是，我們也用1治療小鼠，研究其抑制轉(zhuǎn)移的作用。由于1 s毒性，給藥僅維持12天，此時(shí)小鼠肺結(jié)節(jié)尚未形成。 圖7：（A）通過(guò)監(jiān)測(cè)尿白蛋白歸一化至尿肌酐水平來(lái)測(cè)量其對(duì)腎功能的影響。治療1周后，白蛋白水平穩(wěn)定，表明腎功能改善。（B）收集4處理和對(duì)照處理AS小鼠的腎臟并進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)，成熟和pre-miR-21水平降低，過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體α (PPARα)蛋白水平升高，這是miR-21抑制的一個(gè)靶點(diǎn)。（C）RIBOTAC 4降低Alport和WT小鼠腎臟中pre-miR-21水平。（D）相比之下，未觀察到pERK水平的影響。組織學(xué)研究表明，疾病相關(guān)表型改善，腎小管間質(zhì)病變和腎小球硬化明顯減少。 作者簡(jiǎn)介 研究方向： 迪士尼課題組專注于開(kāi)發(fā)理性和可預(yù)測(cè)的方法，僅從基因組序列設(shè)計(jì)高度選擇性的治療方法?；蚪M測(cè)序工作的主要用途之一是推進(jìn)患者特異性治療，但此類進(jìn)展只有很少的報(bào)道。迪士尼課題組利用從序列中注釋RNA結(jié)構(gòu)的進(jìn)展和實(shí)驗(yàn)室最近開(kāi)發(fā)的一些新技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)這個(gè)崇高的目標(biāo)。迪士尼課題組目前的重點(diǎn)是利用這些技術(shù)進(jìn)步，以確定針對(duì)孤兒病或預(yù)后不良的更常見(jiàn)疾病(如耐藥癌癥)的患者特異性治療。 文獻(xiàn)鏈接 https://pubs.acs.org/10.1021/jacs.1c02248 編輯：唐瑞 審核：路栩 推送：章振華
