自1871年首次合成熒光素以來，這種多功能分子一直是生物學、醫(yī)學和化學生物學中應用最廣泛的熒光團之一。熒光素和相關的氧雜蒽染料的廣泛應用，部分是由于它們的高亮度和廣泛的顏色范圍，只需對氧雜蒽熒光團核心的末端和橋頭原子進行簡單的修改即可。熒光素末端氧原子被氮取代產生另一類氧雜蒽熒光團，即羅丹明。用碳、硅、磷、或硫取代熒光素10′氧原子可以紅移激發(fā)和發(fā)射波長，避免了光毒性和自發(fā)熒光的相關問題，并提高了體內成像的組織穿透能力。相比之下，熒光素的3-羧酸鹽的取代仍然沒有得到充分的研究。3-取代基限制了內消旋環(huán)的自由旋轉，提高了熒光量子產量。在熒光素3號位連上磺酸鹽，不會螺環(huán)化，并改善了其水溶性，這些特性在基于熒光素的電壓敏感型熒光團(VF染料)的設計中起到了重要作用。雖然3位磺酸基熒光素在熒光素報道13年后就有報道。但涉及生物相關的磷酸基團，3-磷酸基熒光素至今仍未有報道。作者探索這類未報道的3-膦熒光素所具有獨特的性質。 加州大學伯克利分?；瘜W與分子細胞生物學助理教授Miller Evan在J. Am. Chem. Soc.上發(fā)表了題為“Phosphonofluoresceins: Synthesis, Spectroscopy, and Applications”的研究論文。在這篇論文中，作者首次開發(fā)了3-磷酸基熒光素的合成路線，表征了這類新的氧雜蒽染料的光譜性質，并用3-磷酸基熒光素在細胞內成像和膜電位傳感。3-磷酸基熒光素的雙乙酰氧基甲酯很容易進入活細胞，表現出良好的積累和保留，與3-羧基熒光素相比，細胞亮度提高了近70倍。3-膦熒光素的游離酸形式不會穿過細胞膜，這使得它非常適合并入電壓敏感支架。基于此，作者合成了電壓敏感熒的熒光團，即phosVF2.1.Cl和Phosphono-VF2.1.Cl，具有優(yōu)良的膜定位性、細胞亮度和電壓敏感性，可與磺酸基VF染料相媲美。 方案一，3-磷酸基熒光素的獨特性質。3-磷酸基熒光素的吸收和發(fā)射相對母體3-羧基熒光素沒有太大的改變。與3-羧基熒光素相比，3-磷酸基熒光素的水溶性更強，即使在低pH值和低介電介質中，3-羧基熒光素仍保持開環(huán)，可見光吸光狀態(tài)，而3-羧基熒光素傾向于內酯化。3-磷酸基熒光素具有優(yōu)良的膜定位性、細胞亮度和電壓敏感性。 方案二，3-磷酸基熒光素的合成路線。在NiCl2催化下，2-溴苯甲醛1以65%的收率合成芳基磷酸酯2。濃鹽酸回流條件下水解為芳基磷酸3，使游離酸收率達到87%。3與間苯二酚在純甲烷磺酸中縮合得到二鹵代膦熒光素4和5。非鹵化熒光素膦(6)也可以通過這條路線制備，但轉化率較低，反應時間較長。 表一，熒光素類化合物的理化性質。pF.Cl(4)的溶解性幾乎是2,7 -二氯-3-羧基熒光素的兩倍，略低于sF.Cl。 圖一，二氯熒光素對pH依賴性的光譜表征。(a) 3-羧基熒光素歸一化吸光度譜圖。(b) 3-羧基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化的滴定曲線。(c) 3-羧基熒光素的pH平衡以及pKa。 (d) 3-磺酸基熒光素歸一化吸光度譜圖。(e) 3-磺酸基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化圖譜。(f) 3-磺酸基熒光素的pH平衡以及pKa。(g) 3-磷酸基熒光素歸一化吸光度譜圖。(h) 3-磷酸基熒光素的歸一化的吸光度隨pH變化圖譜。(i) 3--磷酸基熒光素的pH平衡以及pKa。通過pH滴定實驗表明，3-磷酸基熒光素上有兩個酸性位點，第一個pKa高于3-磺酸熒光素，但低于3-羧酸熒光素，第二個pKa接近生理pH值，這為其功能化提供了機會。與3-羧基熒光素相比，3-磷酸基熒光素在生理pH值下的持續(xù)電離也可能增強水溶性。 方案三，乙酰甲基酯和醚代3-磷酸二氯熒光素的合成。溴甲基乙酸酯和氧化銀條件下，得到開環(huán)和閉環(huán)3-磷酸二氯熒光素兩種產物，以開環(huán)3-磷酸二氯熒光素為主產物。 圖二，3-磷酸二氯熒光素的細胞滲透性。(a, d) 500 nM 4孵育HEK293T細胞20 min后的細胞成像。(b, e) 500 nM 4-AM closed孵育HEK293T細胞20 min后的細胞成像。(c, f) 500 nM 4-AM open著染HEK293T細胞20 min后的細胞成像。4熒光分子不含AM酯，不能滲透細胞膜。4-AM closed的磷酸酯水解速度快由此產生的負電荷使其無法擴散通過細胞膜。4-AM open處理的細胞具有強烈的細胞熒光，表明其細胞通透性高，且具有很高的熒光強度。 圖三，熒光素類熒光團的細胞保留。(a) 熒光素AMs在HEK細胞中的相對亮度比較。(b) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T細胞20 min后的細胞歸一化熒光強度。(c) 500 nM 4-AM open和F-AM Closed孵育HEK293T細胞20 min后的細胞成像。(d) 3-羧基羧熒光素AMs的化學結構 方案三，基于3-磷酸熒光素的膜電位熒光團的合成路線。 圖四，3-磷酸基熒光素膜電位染料在細胞和體外的表征。(a) para phosVF2.1Cl在0.1 M NaOH溶液中的歸一化吸收光譜(實線)和熒光發(fā)射光譜(虛線)。(a) 250 nM para phosVF2.1Cl 孵育HEK293T細胞20 min后的細胞成像。(c)在全細胞電壓鉗固定模式下，單個HEK293T細胞經過100 ms超極化和去極化步驟(以20 mV為增量)后，para phosVF2.1Cl (17) 在HEK293T細胞的細胞膜上熒光隨時間的分數變化曲線。(d) ΔF/F 隨最終膜電位變化圖，顯示電壓靈敏度約為26%/100 mV。 作者首次報道了3-磷酸基熒光素的合成，表征了這類新型熒光團的光譜性質，并在兩個正交活細胞成像應用中使用了3-磷酸基熒光素。通過3-磷酸基熒光素的新合成路線，合成了非鹵化和2,7-二鹵化-3-磷酸基熒光素。其中，2,7-二氯-3-磷酸基熒光素比其他3-羧基類似物更容易溶于水。此外，合成了的5-或6-溴-3-磷酸基熒光素衍生物為電壓敏感的3-磷酸基熒光素。這些新的phosVF染料具有優(yōu)良的膜染色和電壓敏感性，可與性能最好的VF熒光素染料相媲美。3-磷酸基熒光素將在依賴于高度細胞保留的長期成像和電壓成像應用中發(fā)揮作用。 https://pubs.acs.org/doi/pdf/10.1021/jacs.1c01139 Miller Evan，加州大學伯克利分校化學與分子細胞生物學助理教授 2004年，拿撒勒角大學，獲得生物/化學學士，哲學/神學學士。 2009年，加州大學伯克利分校，獲得化學博士(導師為Christopher J. Chang)。 2009-2013年，美國加州大學圣地亞哥分校從事博士后研究（導師為Roger Y. Tsien）。 2013年至今，美國加州大學伯克利分校化學與分子與細胞生物學助理教授， 研究方向包括： 化學生物學，有機化學，熒光顯微鏡，神經科學，成像。 編輯：韓嬌娜 審核：路栩 推送：胥奔鋒
J. Am. Chem. Soc.：3-磷酸基熒光素：合成、光譜和應用
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