今天為大家介紹的是最近在ACS Cent. Sci.上報(bào)道的一篇標(biāo)題為 “Site-Specific Bioconjugation through Enzyme-Catalyzed Tyrosine?Cysteine Bond Formation” 的文章。該文的通訊作者是加利福尼亞大學(xué)伯克利分校的Christof Fellmann教授、Jennifer A. Doudna教授和Matthew B. Francis教授。Matthew B. Francis教授一直在生物有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域頗具建樹(shù)，尤其是位點(diǎn)特異性的蛋白質(zhì)修飾方法的研究。本工作中， Francis課題組再次報(bào)道了新型位點(diǎn)特異性的生物偶聯(lián)反應(yīng)。
擴(kuò)展蛋白與蛋白或多肽的偶聯(lián)方法對(duì)新型疫苗開(kāi)發(fā)、免疫療法和藥物靶向遞送等領(lǐng)域具有重要作用。目前，可控制位點(diǎn)、反應(yīng)條件溫和且產(chǎn)物穩(wěn)定的偶聯(lián)方法，當(dāng)屬自然化學(xué)連接反應(yīng)（NCL）和分選酶介導(dǎo)連接反應(yīng)（SML）。但是這兩種方法只能對(duì)蛋白質(zhì)的N末端或C末端進(jìn)行修飾，其中SML還需要對(duì)蛋白質(zhì)C末端的接頭長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)計(jì)和篩選。因此，開(kāi)發(fā)廣譜性位點(diǎn)特異蛋白修飾反應(yīng)成為新挑戰(zhàn)。
在之前的工作中，Francis課題組發(fā)現(xiàn)，帶有苯胺或N-末端脯氨酸的蛋白可以在含苯酚結(jié)構(gòu)化合物的作用下高產(chǎn)率地修飾上鄰苯醌或鄰亞氨基醌。但是這些反應(yīng)需要通過(guò)高碘酸鹽等強(qiáng)氧化劑進(jìn)行氧化，容易造成蛋氨酸和半胱氨酸氧化等副反應(yīng)。
事實(shí)上早在1967年，人們就發(fā)現(xiàn)利用酪氨酸酶作用于酪氨酸殘基，可實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)交聯(lián)。近兩年，Francis課題組發(fā)現(xiàn)了酪氨酸酶abTYR，它利用水溶液中的溶解氧就可以氧化蛋白質(zhì)中的酚，從而與N-末端脯氨酸殘基或苯胺偶聯(lián)。這個(gè)反應(yīng)避免了強(qiáng)氧化劑的劇烈反應(yīng)條件，減少了副反應(yīng)的發(fā)生。
但是這兩種abTYR介導(dǎo)的反應(yīng)需要高當(dāng)量的N-末端脯氨酸殘基或苯胺，對(duì)蛋白和蛋白之間的偶聯(lián)造成阻礙，使該方法局限于蛋白和多肽的偶聯(lián)。而在本文中，Francis課題組再做突破，他們發(fā)現(xiàn)半胱氨酸的巰基，可以低當(dāng)量參與abTYR介導(dǎo)的蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，且可使蛋白和蛋白之間順利偶聯(lián)（圖1）。
圖1. Francis課題組報(bào)道的酪氨酸酶介導(dǎo)的生物偶聯(lián)反應(yīng)
首先，他們對(duì)MS2（N87C突變）噬菌體衣殼蛋白進(jìn)行了模型反應(yīng)。突變后的蛋白含有一個(gè)半胱氨酸殘基，且會(huì)組裝形成噬菌體衣殼。然而在高度空間擁擠下，95%以上的衣殼蛋白單體均在酪氨酸酶abTYR的催化下在30 min后修飾上了端基為酪氨酸的α-內(nèi)啡肽，可見(jiàn)該反應(yīng)的高效性。每個(gè)蛋白修飾一條多肽。隨后用半胱氨酸加帽試劑N-乙基馬來(lái)酰亞胺（NEM）未見(jiàn)進(jìn)一步修飾，可見(jiàn)該反應(yīng)的半胱氨酸選擇性（圖2）。
圖2. 酪氨酸酶介導(dǎo)的酪氨酸-半胱氨酸偶聯(lián)反應(yīng)的選擇性
為了表征偶聯(lián)產(chǎn)物的化學(xué)結(jié)構(gòu)，作者對(duì)小分子類(lèi)似物進(jìn)行了核磁表征。ROESY 1H NMR結(jié)果表明，產(chǎn)物是由鄰苯醌環(huán)5位與巰基加成而得，主要以鄰苯二酚的形式存在。這與酪氨酸氧化后和苯胺反應(yīng)形成的醌不同，酚產(chǎn)物更穩(wěn)定。DFT計(jì)算結(jié)果也表明，醌與苯胺反應(yīng)產(chǎn)物傾向于以醌形式保留，與硫醇加成產(chǎn)物主要以還原的兒茶酚形式存在，與核磁結(jié)果相符。因此，本工作中的偶聯(lián)產(chǎn)物可以經(jīng)受強(qiáng)還原劑如谷胱甘肽、巰基丁醇而保持穩(wěn)定。
圖3. 醌與硫醇反應(yīng)的核磁分析與DFT計(jì)算
最后，作者將這種偶聯(lián)方法用于功能型蛋白的修飾。Cas9是一種RNA導(dǎo)向的DNA核酸內(nèi)切酶，廣泛用于基因組編輯，在位置80和574處包含兩個(gè)表面半胱氨酸。利用細(xì)胞穿透肽2SV40可促進(jìn)Cas9細(xì)胞核遞送以提高基因編輯效率，但將它們?nèi)诤贤ǔＰ枰蚓庉嫼吐L(zhǎng)的生產(chǎn)周期。但利用酪氨酸酶介導(dǎo)的Tyr-Cys偶聯(lián)反應(yīng)可便捷地對(duì)Cas9進(jìn)行2SV40修飾，結(jié)果顯示Cas9-2SV40基因編輯效率提高了20倍。不僅如此，作者通過(guò)此反應(yīng)用帶Tyr的HER2結(jié)合抗體片段（scFv）與2當(dāng)量的表面帶Cys的綠色熒光蛋白（GFP），實(shí)現(xiàn)了低當(dāng)量的蛋白-蛋白偶聯(lián)反應(yīng)，且不影響scFv對(duì)HER2+癌細(xì)胞的結(jié)合活性。
總的來(lái)說(shuō)，Francis課題組利用新型酪氨酸酶abTYR介導(dǎo)的Tyr與Cys位點(diǎn)特異性偶聯(lián)反應(yīng)，可用于蛋白與多肽或蛋白之間的有效偶聯(lián)反應(yīng)。Cys可以是蛋白質(zhì)表面的任一位點(diǎn)，該反應(yīng)條件溫和，不需強(qiáng)氧化劑，偶聯(lián)產(chǎn)物穩(wěn)定。作為一種新型有效的位點(diǎn)特異性生物偶聯(lián)方法，相信它在生物醫(yī)藥領(lǐng)域?qū)⒕哂泻芎玫膽?yīng)用前景。
作者：SJL 審校：ZHS
DOI: 10.1021/acscentsci.0c00940
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acscentsci.0c00940
