今天給大家分享一篇近期發(fā)表在Biomacromolecules上的文章，題為：Phase-Separated Multienzyme Biosynthesis。這篇工作中，作者在相分離形成的蛋白質(zhì)凝集體中通過(guò)自組裝作用引入催化酶，在體外構(gòu)建了多酶生物合成體系。并且，相分離帶來(lái)的濃縮效應(yīng)，促使級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)更高效的進(jìn)行。文章的通訊作者是來(lái)自香港中文大學(xué)的夏江教授，他主要從事蛋白質(zhì)化學(xué)及酶工程方面的研究。液-液相分離（LLPS）是細(xì)胞中非常普遍的一個(gè)過(guò)程，生物大分子間通過(guò)多價(jià)相互作用，在高于臨界濃度時(shí)會(huì)自發(fā)形成凝集體。這些凝集體被稱(chēng)為“無(wú)膜區(qū)室”，它們具有流動(dòng)性與動(dòng)態(tài)性，并且能夠選擇性地富集特定分子，從而提高級(jí)聯(lián)催化過(guò)程的效率。這是因?yàn)楫?dāng)酶和底物聚集在凝集體中，可與其他代謝途徑隔離，并且底物通道效應(yīng)（級(jí)聯(lián)反應(yīng)過(guò)程中反應(yīng)中間物在兩個(gè)酶之間的直接傳遞）也使得酶促反應(yīng)的速率大大提高。先前已有將相分離過(guò)程應(yīng)用于多酶復(fù)合物的策略，例如通過(guò)將相形成過(guò)程中的骨架蛋白與被招募的蛋白直接融合表達(dá)，但這可能會(huì)影響正常的相分離過(guò)程。因此，作者在這里提出一種通過(guò)肽-肽相互作用將被招募者引入凝集體中的方法。作者選擇了一對(duì)高親和力相互作用的短肽，RIDD與RIAD。而用于與酶進(jìn)行組裝的相分離體系由三種骨架蛋白組成，GKAP、Shank、Homer（它們是突觸后致密區(qū)PSD中的主要蛋白，混合后可以發(fā)生相分離并自發(fā)形成凝集體）。作者首先探究了引入多肽RIAD是否會(huì)對(duì)正常的相分離過(guò)程產(chǎn)生影響。通過(guò)融合表達(dá)構(gòu)建RIAD-Shank與RIAD-Homer，并與GKAP混合，獲得了渾濁溶液。顯微鏡下可以觀察到凝集體，超速離心分離沉淀相并進(jìn)行SDS-PAGE也能夠觀察到大多數(shù)的骨架蛋白，如圖1所示。以上的結(jié)果說(shuō)明成功發(fā)生相分離，RIAD的融合幾乎沒(méi)有影響。
圖1. RIAD融合后的相分離體系 (A)設(shè)計(jì)原理 (B)SDS-PAGE結(jié)果
隨后作者通過(guò)RIDD-RIAD相互作用將蛋白引入到凝集體中。首先以單個(gè)蛋白EGFP-RIDD作為模型進(jìn)行嘗試。激光共聚焦顯微鏡的結(jié)果表明通過(guò)簡(jiǎn)單的混合，即可有效的將EGFP-RIDD引入到凝集體中，凝集體中的熒光信號(hào)比溶液中高出50倍。對(duì)凝集體中原有骨架蛋白的分析等也表明凝集體的正常性質(zhì)沒(méi)有受到被引入蛋白的影響。
進(jìn)一步地，作者測(cè)試了凝集體中同時(shí)引入兩種熒光蛋白，分別構(gòu)建了CFP-RIDD與YFP-RIDD。如圖2B，可以觀察到CFP與YFP熒光信號(hào)的共定位，這說(shuō)明一個(gè)凝集體中能夠同時(shí)引入兩種蛋白。通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移（FRET）的實(shí)驗(yàn)，如圖2C，CFP的熒光壽命在加入YFP后降低，表明凝集體中CFP與YFP距離接近能夠發(fā)生FRET反應(yīng)。
圖2. 凝集體中肽-肽相互作用驅(qū)動(dòng)兩種熒光蛋白的組裝 (A)設(shè)計(jì)原理 (B)激光共聚焦顯微鏡
(C)熒光共振能量轉(zhuǎn)移測(cè)定供體熒光壽命
接下來(lái)作者將一個(gè)級(jí)聯(lián)酶促反應(yīng)體系引入至凝集體中。Idi與IspA是萜類(lèi)生物合成中關(guān)鍵的兩個(gè)酶。分別構(gòu)建Idi-RIDD與RIDD-IspA，并通過(guò)Cy5熒光標(biāo)記。作者構(gòu)建了三個(gè)多酶催化系統(tǒng)，以比較有無(wú)肽-肽相互作用時(shí)的催化效率。結(jié)果如圖3所示，兩種酶在凝集體中得到顯著富集；表觀反應(yīng)速率反映RIDD-RIAD相互作用使催化活性提高了50%。
圖3. 凝集體中萜類(lèi)合成酶的組裝促進(jìn)催化 (A)三種酶體系示意圖(B)激光共聚焦顯微鏡 (C)三種酶體系中初始產(chǎn)物生成速率
綜上所述，在這項(xiàng)研究中，作者將能發(fā)生相分離的一些蛋白設(shè)計(jì)為支架，并通過(guò)設(shè)計(jì)的特異肽-肽相互作用驅(qū)動(dòng)多種酶與凝集體的同時(shí)組裝。文中的例子表明，通過(guò)這種物理組裝將相分離體系與多酶催化結(jié)合，能夠帶來(lái)顯著的富集效果與提高的催化活性。
作者：ZRC 審校：SJL
DOI: 10.1021/acs.biomac.0c00321
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/acs.biomac.0c00321
