今天為大家分享一篇最近發(fā)表在JACS上的文章，Protein?Protein Cross-Coupling via Palladium?Protein Oxidative Addition Complexes from Cysteine Residues。這篇文章的通訊作者是麻省理工學(xué)院的Stephen L. Buchwald教授和Bradley L. Pentelute教授。
能夠作用于蛋白質(zhì)的生物偶聯(lián)技術(shù)是非常重要的。目前，除了酶技術(shù)以外，蛋白質(zhì)位點(diǎn)特異性的化學(xué)修飾通常采用以下方法，即首先在多肽鏈中插入一個(gè)側(cè)鏈具有獨(dú)特反應(yīng)性的非天然氨基酸或者直接利用低豐度的活性天然氨基酸作為活性位點(diǎn)，隨后通過對相應(yīng)側(cè)基進(jìn)行位點(diǎn)特異的偶聯(lián)以實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的修飾。在前一種策略中，最常見的方法就是通過Click反應(yīng)將修飾物與插入蛋白中的非天然氨基酸側(cè)基連接起來，此法適用范圍廣泛，使大分子或小分子都能特異性的結(jié)合到蛋白質(zhì)上；而后一種策略則利用了低豐度天然氨基酸殘基較強(qiáng)的反應(yīng)活性以及在蛋白質(zhì)中位點(diǎn)的特異性，相對增強(qiáng)了修飾試劑的化學(xué)選擇效果，避免了插入非天然氨基酸帶來的不利因素。半胱氨酸具有獨(dú)特反應(yīng)活性，同時(shí)豐度又較低，是對天然氨基酸進(jìn)行有效修飾的首選。本文作者利用蛋白上的半胱氨酸殘基與鈀配合物形成鈀-蛋白復(fù)合物，該復(fù)合物可以實(shí)現(xiàn)含有半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)之間的交叉偶聯(lián)。
在傳統(tǒng)的鈀催化的偶聯(lián)反應(yīng)中（圖1A），需要有一個(gè)芳基鹵化物底物(Ⅲ)與零價(jià)鈀(Ⅱ)發(fā)生氧化加成反應(yīng)得到氧化加成復(fù)合物(Ⅳ)。該親電中間體可以被親核試劑捕捉，然后通過還原消除反應(yīng)實(shí)現(xiàn)親核試劑與底物的偶聯(lián)。但是，如果底物是蛋白質(zhì)的話，往往需要大大過量的鈀試劑(50 eq.)和親核試劑(500 eq.)來捕捉鈀-蛋白復(fù)合物中間體。因此作者設(shè)想，利用1,4-二鹵代芳烴與鈀形成的氧化加成復(fù)合物與半胱氨酸殘基反應(yīng)，再進(jìn)行分子內(nèi)氧化加成預(yù)先合成鈀-蛋白氧化加成復(fù)合物（圖1B），然后再將其與親核性物種直接發(fā)生反應(yīng)偶聯(lián)（圖1C），這樣便可以有效提高偶聯(lián)反應(yīng)的效率。在之前的研究中，作者已經(jīng)報(bào)道了可以從小分子獲得穩(wěn)定的鈀氧化加成復(fù)合物用于肽和蛋白質(zhì)的半胱氨酸殘基的交叉偶聯(lián)。但是對于蛋白質(zhì)來說，它需要在水溶液中才能穩(wěn)定存在，這與傳統(tǒng)制備鈀氧化加成復(fù)合物時(shí)用到的有機(jī)溶劑不相容，因此該反應(yīng)仍需要進(jìn)一步改進(jìn)。
圖1. 一種從半胱氨酸殘基生成鈀-蛋白氧化加成復(fù)合物的方法及其在蛋白質(zhì)交叉偶聯(lián)中的應(yīng)用
作者用模型多肽Z33作為底物進(jìn)行了反應(yīng)的優(yōu)化，在這個(gè)多肽鏈中只引入了一個(gè)半胱氨酸殘基（圖2）。作者預(yù)期會有兩種可能的反應(yīng)途徑：成功進(jìn)行分子內(nèi)氧化加成生成化合物4或者鈀分解生成化合物5。通過改變配體、改變鹵素原子、改變?nèi)軇┨砑觿┮约暗孜餄舛?，最終作者發(fā)現(xiàn)在10 μM的底物濃度下，使用試劑L3-Pd-I以及添加5%的DMF可以得到較高的轉(zhuǎn)化率和較高的產(chǎn)物比(4 : 5)，并且不會產(chǎn)生沉淀(Entry 9)。在這個(gè)反應(yīng)中鈀試劑采用10當(dāng)量，這是為了降低底物之間直接發(fā)生二聚的可能性。
圖2. 合成鈀-蛋白氧化加成復(fù)合物的條件篩選
進(jìn)一步，作者將多肽底物換成了僅含一個(gè)半胱氨酸殘基的蛋白質(zhì)，選用的蛋白質(zhì)有炭疽保護(hù)抗原的半胱氨酸變體(mPA, 83 kDa)，T4 溶菌酶(19kDa)，SUMO-DARPin (27 kDa)。LC-MS分析產(chǎn)物顯示，這些蛋白質(zhì)都能以較高的轉(zhuǎn)化率生成鈀-蛋白氧化加成復(fù)合物。并且作者發(fā)現(xiàn)，Pd-mPA氧化加成復(fù)合物可以在緩沖液中保存一天，反應(yīng)活性不會下降。
接下去，作者選用了大分子量的Pd-mPA復(fù)合物來研究蛋白偶聯(lián)的反應(yīng)性。在將mPA轉(zhuǎn)化為相應(yīng)的鈀氧化加成復(fù)合物后，作者用鎳柱和SEC對其進(jìn)行了純化。作者繼續(xù)選用天然蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基進(jìn)行蛋白質(zhì)交叉偶聯(lián)，利用SDS-PAGE評估了反應(yīng)轉(zhuǎn)化率，轉(zhuǎn)化率為57%-79%（圖3）。
與另一種獲取蛋白-蛋白偶聯(lián)物的方法——基因表達(dá)相比，利用本文中提到的方法，單獨(dú)折疊的蛋白之間可以直接通過側(cè)鏈半胱氨酸殘基偶聯(lián)得到蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，不需要對共表達(dá)蛋白的母質(zhì)粒進(jìn)行重新設(shè)計(jì)，從而在一定程度上降低了獲得蛋白-蛋白偶聯(lián)物的技術(shù)難度。
圖3. 蛋白質(zhì)的交叉偶聯(lián)反應(yīng)
總之，作者報(bào)道了一種在水相條件下，通過鈀-轉(zhuǎn)移策略在含有半胱氨酸殘基的蛋白底物上合成穩(wěn)定的鈀-蛋白氧化加成復(fù)合物的方法，可以有效實(shí)現(xiàn)半胱氨酸殘基側(cè)鏈的蛋白交叉偶聯(lián)。這種策略在合成抗體-藥物偶聯(lián)物和抗體-蛋白偶聯(lián)物的領(lǐng)域中具有廣闊的應(yīng)用前景。
DOI: 10.1021/jacs.0c03143
Link: https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.0c03143
