今天給大家推薦的是最近發(fā)表在Chemical Science上的一篇文章，題為“Secondary amine selective Petasis (SASP) bioconjugation”，通訊作者為奧本大學(xué)的Monika Raj。
位點特異的選擇性修飾蛋白在生化分析、治療、生物工程等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。這樣的合成需要很好的化學(xué)選擇性甚至區(qū)域選擇性生物偶聯(lián)反應(yīng)。常見的修飾方法有半胱氨酸殘基的烷基化、基于非天然氨基酸的正交反應(yīng)、自然化學(xué)連接、酶催化手段等等。針對N末端的特異性偶聯(lián)，已報道的有基于半胱氨酸、色氨酸、絲氨酸、蘇氨酸的，也有通過調(diào)節(jié)pH特異性與N末端氨基反應(yīng)的。但能夠與二級胺選擇性反應(yīng)，或者說與脯氨酸特異性偶聯(lián)的方法尚無報道。由于脯氨酸（pKa=10.6）在生理條件下比一級胺（pKa=9.5）反應(yīng)活性弱，且與賴氨酸側(cè)鏈（pKa=10.6）反應(yīng)活性類似，脯氨酸的特異生物反應(yīng)在化學(xué)上一度面臨挑戰(zhàn)。而本文報道的便是一種二級胺選擇性Petasis反應(yīng)，用于N末端脯氨酸特異性生物偶聯(lián)。
圖1. 選擇性反應(yīng)原理
這是一種多組分的二級胺選擇性Petasis反應(yīng)（圖1），首先二級胺在水中的親核性（N=17）比一級胺（N=12）更高，利用醛與二級胺反應(yīng)生成更加親電的亞胺離子，亞胺離子迅速與親核性的有機金屬硼酸鹽反應(yīng)得到產(chǎn)物。在一鍋反應(yīng)里，能迅速生成位點特異的產(chǎn)物，且該反應(yīng)具有立體選擇性（＞99% de）。
圖2. 反應(yīng)在三肽中的選擇性
首先作者在三肽中進行了選擇性驗證（圖2）。合成得到了20種三肽，XAF（X代表任何一個天然氨基酸）。將20種XAF分別與醛（2a）、硼酸鹽（3a）在pH 7.3的磷酸鹽緩沖液與DMF混合溶劑（4:1）中室溫進行反應(yīng)，LCMS檢測發(fā)現(xiàn)僅有PAF發(fā)生了反應(yīng)，反應(yīng)程度70%。后將20種三肽混合，也僅有PAF發(fā)生了反應(yīng)。體現(xiàn)了很好的化學(xué)選擇性。在對立體選擇性的研究中發(fā)現(xiàn)，與L-脯氨酸反應(yīng)得到了的產(chǎn)物為R型，而與D-脯氨酸反應(yīng)則得到S型（de＞99%）。
圖3. 不同官能團底物
隨后進行了反應(yīng)優(yōu)化。將PBA替換為水溶性更好的PMB，在pH 7.3的磷酸鹽緩沖液與DMSO混合溶劑（4:1）中反應(yīng)2h，程度可達到90%。針對PAF，發(fā)現(xiàn)其與SAL、PMB反應(yīng)的產(chǎn)物在pH 6.5-9.5十分穩(wěn)定，完全不水解；在不同pH下，pH高反應(yīng)轉(zhuǎn)化率更高，在7.3十五分鐘轉(zhuǎn)化62%，而9.5轉(zhuǎn)化80%。生理條件下轉(zhuǎn)化率也不差，因此后續(xù)反應(yīng)也都在pH 7.3進行。對于其他不同官能團的底物也進行了嘗試，多種產(chǎn)率都很高。
圖4. 生物活性多肽的二級胺特異性反應(yīng)
進一步，與包含賴氨酸側(cè)鏈或半胱氨酸側(cè)鏈的寡肽PFKAFV、PFCAF反應(yīng)，也僅有N末端的脯氨酸被修飾了，顯示出高選擇性。與具有生物活性的多肽反應(yīng)，如血管緊縮素I（PDRVYIHPFHL），一種能夠?qū)е卵苁湛s血壓升高的肽激素；緩激肽（PPGFSPFR），一種炎癥調(diào)節(jié)因子；高海藻糖神經(jīng)肽（PVNFSPGWGT）及胰島素A鏈截取出來的多肽（PICSLYQLENYCN），均顯示出很好的單一位點反應(yīng)性。
圖5. 蛋白的二級胺特異性反應(yīng)
最后，在蛋白層面，與天然N末端無脯氨酸的肌紅蛋白、α-乳清蛋白，以及N末端具有脯氨酸的醛縮酶、肌酸激酶反應(yīng)，僅后者發(fā)生了反應(yīng)，且從圓二色譜來看，該修飾對蛋白二級結(jié)構(gòu)幾乎未造成影響。
總的來說，本文發(fā)展了一種針對二級胺的生物偶聯(lián)方法，在生理條件下可以對其進行雙重標記，且該反應(yīng)具有立體選擇性，產(chǎn)物穩(wěn)定，底物多樣。
作 者：HYL 審 校：WH
Raj, M., et al., Chemical Science 2020, 11 (1), 53-61.
Link：https://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2020/SC/C9SC04697F
