跟大家分享一篇今年6月份發(fā)表在Nature Chemical Biology的文章，文章的題目是：Discovery of small-molecule enzyme activators byactivity-based protein profiling（通過(guò)基于活性的蛋白質(zhì)圖譜發(fā)現(xiàn)小分子酶激活劑）。文章的通訊作者是Enrique Saez教授和Dale L. Boger教授。Enrique Saez教授分別于普林斯頓大學(xué)和哈佛大學(xué)獲得學(xué)士和博士學(xué)位，目前擔(dān)任斯克里普斯研究所助理教授，主要研究方向是：作為營(yíng)養(yǎng)傳感器的核受體和能量?jī)?chǔ)存的遺傳調(diào)節(jié)。Dale L. Boger教授分別于堪薩斯大學(xué)和哈佛大學(xué)獲得學(xué)士和博士學(xué)位，目前擔(dān)任斯克里普斯研究所教授，主要研究方向是：生物活性天然產(chǎn)物的全合成、新合成方法的開(kāi)發(fā)、雜環(huán)化學(xué)、生物有機(jī)和藥物化學(xué)、組合化學(xué)和DNA-試劑相互作用的研究以及抗腫瘤抗生素的化學(xué)。
研究背景：絲氨酸水解酶是哺乳動(dòng)物中多樣化的酶類(lèi)之一，在許多生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。目前，約有一半的絲氨酸水解酶的功能和底物還沒(méi)有被發(fā)現(xiàn)，溶血磷脂類(lèi)酶1（LYPLAL1）就是其中一個(gè)例子。LYPLAL1與人類(lèi)代謝疾?。òǚ逝?、2型糖尿病、高密度脂蛋白膽固醇水平和非酒精性脂肪肝等）密切相關(guān)。ABPP是一種基于與活性位點(diǎn)可共價(jià)結(jié)合的小分子探針直接研究酶功能狀態(tài)的蛋白質(zhì)組學(xué)策略。競(jìng)爭(zhēng)性ABPP已被用于鑒定酶抑制劑，并且適用于通過(guò)熒光偏振監(jiān)測(cè)酶-探針相互作用的高通量篩選。研究發(fā)現(xiàn)利用ABPP發(fā)展的LYPLAL1抑制劑很可能對(duì)治療代謝疾病是有害的，同時(shí)提示增加LYPLAL1的表達(dá)，或者通過(guò)藥物提高LYPLAL1的活性，可能有利于影響葡萄糖的產(chǎn)生和改善代謝功能障礙。目前，開(kāi)發(fā)了許多選擇性試劑來(lái)輔助絲氨酸水解酶的功能表征。作者推想ABPP的多功能性也可能實(shí)現(xiàn)小分子酶激活劑鑒定，本文就利用ABPP對(duì)LYPLAL1酶的激活劑進(jìn)行了鑒定。
作者利用了2006年Cravatt 組發(fā)展的基于ABPP的熒光偏振分析技術(shù)和純化的mLYPLAL1篩選了16000個(gè)小分子庫(kù)（在這個(gè)實(shí)驗(yàn)中，羅丹明標(biāo)記的氟磷酸酯(FP)探針與LYPLAL1的反應(yīng)導(dǎo)致依賴于時(shí)間的熒光偏振信號(hào)的增加，這反映了通過(guò)FP探針與LYPLAL1中催化中心絲氨酸共價(jià)結(jié)合所測(cè)量的酶活性）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)很多小分子熒光極化降低，說(shuō)明這些小分子可能是LYPLAL1的抑制劑；同時(shí)還有許多其他化合物增強(qiáng)了熒光偏振信號(hào)，它們可能作為功能獲得性配體或激活劑。作者選擇了一些化合物并利用膠圖進(jìn)行驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)其中有些化合物增加了LYPLAL1的ABPP信號(hào)強(qiáng)度，證實(shí)了它們能夠增強(qiáng)FP -羅丹明與酶活性位點(diǎn)的反應(yīng)能力。進(jìn)一步作者將這些LYPLAL1激活劑中信號(hào)最優(yōu)的一種用于更廣泛的表征。
圖1.Activity-based protein profiling （ABPP）方法 ( FP-羅丹明探針作用實(shí)驗(yàn)示意圖)
研究?jī)?nèi)容：之前篩選文庫(kù)的化合物結(jié)構(gòu)與公司購(gòu)買(mǎi)的化合物結(jié)構(gòu)在光譜和色譜上相同。當(dāng)研究人員合成時(shí)，發(fā)現(xiàn)了異構(gòu)結(jié)構(gòu)4，這表明在商業(yè)篩選中有許多相關(guān)化合物可能被類(lèi)似地錯(cuò)誤識(shí)別。本文，作者選用自己合成的4進(jìn)行接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)研究。
圖2.LYPLAL1小分子激活劑（PAL-4）的合成
將純化的小鼠（a）或人（b）LYPLAL1蛋白與濃度遞增的探針4孵育，然后用羅丹明-氟磷酸酯和基于凝膠的ABPP分析進(jìn)行標(biāo)記，發(fā)現(xiàn)基于凝膠的ABPP的純酶的分析中觀察到活性的增加，PAL-4 (溶血磷脂類(lèi)酶1 LYPLAL1-4 的藥理學(xué)激活劑)產(chǎn)生了濃度依賴的約2.5倍和2.3倍增強(qiáng)，這表明4的直接結(jié)合使LYPLAL1活性增強(qiáng)。
圖3. 純化的小鼠（a）或人（b）的LYPLAL1蛋白與不同濃度的t探針4孵育的凝膠分析圖
將mLYPLAL1與探針4、羅格列酮（陰性對(duì)照）或帶有生物素的氟磷酸酯（共價(jià)）孵育，反應(yīng)一半體積通過(guò)凝膠過(guò)濾柱，然后用FP-若丹明標(biāo)記并進(jìn)行基于凝膠的ABPP分析。4處理的凝膠過(guò)濾樣品中添加的羅丹明-氟磷酸酯標(biāo)記損失表明4是可逆活化劑。
圖4. mLYPLAL1與其他探針的作用效果對(duì)比圖
有研究證明，LYPLAL1對(duì)4-硝基苯乙酸酯（PNPA）有水解作用。為了驗(yàn)證4提高了LYPLAL1催化活性，而不是促進(jìn)FP探針的反應(yīng)性，作者測(cè)試了4在LYPLAL1對(duì)4-硝基苯乙酸酯（PNPA）作用的影響。4（10μM）處理肝癌細(xì)胞裂解液后，用帶炔基的FP探針?lè)跤⒒?/span>MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LYPLAL1活性顯著增加，而在這些實(shí)驗(yàn)中定量的其他49個(gè)絲氨酸水解酶則不受影響。綜上所述， PAL-4是LYPLAL1的有效的、選擇性的、可逆的激活劑。
圖5.化合物4選擇性激活內(nèi)源性LYPLAL1
探針4的發(fā)現(xiàn)代表首次用ABPP檢測(cè)到小分子激活酶，是小分子誘導(dǎo)的絲氨酸水解酶的酶活性增強(qiáng)的第一個(gè)例子，通過(guò)ABPP繼續(xù)探究化合物4的相關(guān)性質(zhì)。發(fā)現(xiàn)：(1)接頭中的硫原子是必需的；(2)苯基同樣是活性所必需的；(3)并非所有密切相關(guān)的硫代苯甲基取代基都傳遞活性；(4)苯甲基上的4-氯取代基活性最強(qiáng)且最有效等。
圖6. 結(jié)構(gòu)-活性研究
純酶得到驗(yàn)證后，作者將探針4用于蛋白組研究中。用不同的化合物分別作用于復(fù)雜的蛋白組中，發(fā)現(xiàn)在復(fù)雜蛋白質(zhì)組中比用純化酶測(cè)試時(shí)更有效地增強(qiáng)LYPLAL1活性，且10-14顯示出比4更大的激活作用；挑選激活作用較明顯的化合物12與4進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)12與純化的LYPLAL1的相互作用親和力大于4；重組mLYPLAL1與4或12一起孵育會(huì)降低酶的熱穩(wěn)定性。用12處理細(xì)胞裂解液后，用帶炔基的FP探針?lè)跤⒒?/span>MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)LYPLAL1活性顯著增加，而這些實(shí)驗(yàn)中定量的其他絲氨酸水解酶則不受影響。
作者緊接著對(duì)LYPLAL1的藥理激活模式進(jìn)行研究，LYPLAL1突變體在人胚胎腎細(xì)胞中表達(dá)，收集其蛋白質(zhì)組、孵育，其中對(duì)照組為空白，實(shí)驗(yàn)組為12孵育，然后再進(jìn)行基于凝膠的ABPP分析實(shí)驗(yàn)。結(jié)構(gòu)模擬結(jié)合位點(diǎn)突變、生化和生物物理分析表明，12和其他活化劑可能通過(guò)改變催化三聯(lián)體(Ser124、Asp179和His211)的氫鍵網(wǎng)絡(luò)來(lái)實(shí)現(xiàn)變構(gòu)調(diào)節(jié)，增加LYPLAL1的活性，這和Arg80突變體的作用是一致的。
圖7. 關(guān)鍵的非催化殘基調(diào)節(jié)LyPLAL1活性和藥理學(xué)活化劑功效
接下來(lái)，對(duì)化合物12進(jìn)行體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的探究，并發(fā)現(xiàn)12可增強(qiáng)LYPLAL1在體內(nèi)的活性。給小鼠服用12或C11（一種有效的共價(jià)LYPLAL1抑制劑）后，向所有小鼠注射LYPLAL1的炔烴探針，通過(guò)基于凝膠的ABPP進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，與酶有共價(jià)作用的C11將不會(huì)再標(biāo)記到酶，而12可增強(qiáng)LYPLAL1在體內(nèi)的活性。
圖8. 化合物12增強(qiáng)體內(nèi)LYPLAL1活性譜圖
最后，小鼠腹腔分別給藥（注射12），發(fā)現(xiàn)其空腹血糖降低，葡萄糖耐量提高，胰島素敏感性提高，肝損害標(biāo)志物的血漿水平升高等現(xiàn)象。12和抑制劑C11雙重給藥消除了12對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)和胰島素敏感性的作用，表明LYPLAL1活性是12體內(nèi)作用所必需的。
本文證明了可利用競(jìng)爭(zhēng)性ABPP來(lái)鑒定和優(yōu)化溶血磷脂類(lèi)酶1（LYPLAL1）的小分子激活劑，以表征該酶并闡明其與代謝性狀的聯(lián)系；表明了ABPP可以用于尋找絲氨酸水解酶功能的藥理激活劑，從而建立了新的調(diào)控模式，為開(kāi)發(fā)小分子激活劑提供了理論依據(jù)；說(shuō)明了關(guān)鍵的非催化殘基在驅(qū)動(dòng)小分子和突變誘導(dǎo)的LYPLAL1活化中的靜電作用的核心作用；LYPLAL1激活劑可能在代謝紊亂的治療中有重要作用，在體內(nèi)阻斷LYPLAL1可能會(huì)對(duì)葡萄糖穩(wěn)態(tài)產(chǎn)生負(fù)面影響；這些化學(xué)工具和化學(xué)方法將有助于其他酶的功能研究和藥理驗(yàn)證。
