近日，北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院王初課題組在Chemical Science雜志上在線發(fā)表題為"Chemical proteomic profiling of protein N-homocysteinylation with a thioester probe"的研究文章。
高半胱氨酸是甲硫氨酸和半胱氨酸代謝過程中一個(gè)重要的中間體。在人體中，相關(guān)代謝酶的缺陷和營(yíng)養(yǎng)元素的缺乏都會(huì)導(dǎo)致血液中總高半胱氨酸濃度的上升，高于15μmol/L即患有高同型半胱氨酸血癥，目前的研究發(fā)現(xiàn)該病和許多血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。血液中過量的高半胱氨酸會(huì)在甲硫氨酰tRNA合成酶的錯(cuò)誤剪輯下轉(zhuǎn)化成具有高化學(xué)反應(yīng)活性的高半胱氨酸硫內(nèi)酯。高半胱氨酸硫內(nèi)酯可以與蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基生成N-高半胱氨?；揎棧撔揎検且环N非酶催化的蛋白質(zhì)翻譯后修飾，可以引起蛋白質(zhì)損傷，聚集和自身免疫應(yīng)答，被認(rèn)為是高同型半胱氨酸血癥的一個(gè)重要致病因素。然而目前報(bào)道的檢測(cè)方法包括高效液相色譜法，抗體法和醛基標(biāo)記法，都受限于靈敏度，而且很難鑒定蛋白質(zhì)和修飾位點(diǎn)。
化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展極大促進(jìn)了生物體系中蛋白質(zhì)翻譯后修飾的鑒定。因此，結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室在化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)方面的技術(shù)，我們發(fā)展了選擇性標(biāo)記N-高半胱氨?；揎椀奶结?，并將其成功應(yīng)用于復(fù)雜蛋白質(zhì)組體系中。該課題設(shè)計(jì)靈感來自于蛋白質(zhì)合成中廣泛使用的自然化學(xué)連接方法，其改進(jìn)策略之一甲硫氨酸連接法中使用的N端高半胱氨酸恰好與我們所研究的N-高半胱氨酰化修飾結(jié)構(gòu)一致，因此，我們推測(cè)硫酯結(jié)構(gòu)可以選擇性的標(biāo)記N-高半胱氨酰化修飾。
首先我們合成了一系列炔基硫酯探針和N-高半胱氨?；揎楊愃莆?，在小分子反應(yīng)中發(fā)現(xiàn)MPAA（對(duì)巰基苯乙酸）衍生化探針AT-3表現(xiàn)出最快的反應(yīng)速率，其中MPAA是自然化學(xué)連接中常用的硫醇輔助劑。所以我們將AT-3應(yīng)用于了后續(xù)的蛋白質(zhì)標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中。由于生理?xiàng)l件下，硫酯可以和賴氨酸殘基發(fā)生副反應(yīng)，因此我們?cè)趩我坏鞍踪|(zhì)水平上對(duì)標(biāo)記條件進(jìn)行了優(yōu)化，選擇了pH 6環(huán)境中標(biāo)記30min，在多個(gè)單一蛋白質(zhì)上均具有很好的標(biāo)記選擇性。最后我們將該探針應(yīng)用于了復(fù)雜蛋白質(zhì)組中，結(jié)合同位素二甲基化標(biāo)記策略，在invitro和in situ條件下鑒定了超過1000個(gè)可能蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，并進(jìn)行了驗(yàn)證。對(duì)這些修飾靶點(diǎn)分析發(fā)現(xiàn)很多分布在細(xì)胞附著，翻譯起始和蛋白質(zhì)折疊等通路中，而且豐度較高。這與文獻(xiàn)中報(bào)道該修飾與人血漿中蛋白質(zhì)豐度成比例的結(jié)果相一致。最后，我們利用可光切除生物素標(biāo)簽對(duì)N-高半胱氨酰化修飾位點(diǎn)進(jìn)行了準(zhǔn)確鑒定，首次報(bào)道了304個(gè)高置信度的修飾位點(diǎn)，功能分析發(fā)現(xiàn)該修飾可能與賴氨酸上其它翻譯后修飾，例如乙?；P(guān)系密切。
盡管自然化學(xué)連接已經(jīng)報(bào)道超過20年，但其應(yīng)用僅僅局限于蛋白質(zhì)合成中。我們的工作利用了N-高半胱氨?；揎椀奶厥饨Y(jié)構(gòu)，第一次將該化學(xué)拓展至了疾病相關(guān)的蛋白質(zhì)翻譯后修飾分析中。該方法的發(fā)展也將有助于揭示高同型半胱氨酸血癥相關(guān)疾病的分子機(jī)制。本文通訊作者為北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院和北大-清華生命聯(lián)合中心王初研究員，第一作者為北京大學(xué)化學(xué)與分子工程學(xué)院2013級(jí)博士研究生陳南，王初課題組本科生劉錦民，喬澤宇，博士后劉源對(duì)該工作的完成做出了貢獻(xiàn)，同時(shí)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部王憲教授，姜長(zhǎng)濤教授和博士生楊越也參與合作。
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http://pubs.rsc.org/en/content/articlelanding/2018/sc/c8sc00221e#!divAbstract
文章引用：
Nan Chen,Jinmin Liu, Zeyu Qiao, Yuan Liu, Yue Yang, Changtao Jiang, Xian Wang and ChuWang* Chem.Sci.,2018, Advance Article DOI：10.1039/C8SC00221E
