今天分享一篇發(fā)表在JACS上的文章：Engineering Bioactive Dimeric Transcription Factor Analogs via Palladium Rebound Reagents，通訊作者是來自麻省理工學(xué)院的Bradley L. Pentelute教授，他們課題組的研究方向是蛋白化學(xué)修飾，多肽類型配體的發(fā)現(xiàn)，以及生物大分子的流動合成與細胞遞送。
Myc基因是一種重要的原癌基因，它編碼的轉(zhuǎn)錄因子Myc被發(fā)現(xiàn)在50%的癌癥細胞中均過度表達，異常表達的Myc在細胞核內(nèi)與另一種轉(zhuǎn)錄因子Max形成異源二聚體，進而可被DNA上的E-box(enhance box)識別，啟動多種與細胞增殖等過程相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄，最終造成異常的細胞增殖。轉(zhuǎn)錄因子Max除了能夠與Myc結(jié)合啟動轉(zhuǎn)錄外，同源二聚的Max可與Max/Myc復(fù)合物競爭結(jié)合DNA底物，進而抑制Myc下游的轉(zhuǎn)錄過程。由于Myc缺乏與小分子結(jié)合的口袋，靶向Myc的藥物往往選擇性差，結(jié)合能力弱，此前也有報道利用體外合成的二硫鍵等共價連接的Max同源二聚體來競爭性地抑制Myc通路，然而由于連接用到的化學(xué)鍵在生理條件下不穩(wěn)定，難以用于細胞內(nèi)的研究，因此本文作者希望利用鈀氧化加成復(fù)合物來合成更為穩(wěn)定的Max同源二聚體，從而用于Myc通路相關(guān)的研究。
他們利用此前開發(fā)的流動多肽合成技術(shù)合成了C端帶有額外一個Cys的Max，Myc以及一個工程化后的Myc類似物OmoMyc，通過與其DNA底物進行孵育，再用凝膠上的遷移證實了Max和OmoMyc的同源二聚體均能結(jié)合DNA，且與此前的報道一致，Myc的二聚體不具有結(jié)合DNA的能力。為了合成不同的二聚體蛋白，他們利用一種二價鈀氧化加成復(fù)合物與單體進行反應(yīng)，被巰基取代下的鈀可再對芳-碘鍵進行一次氧化加成，進而連接上另一個巰基，第一步氧化加成后得到的中間產(chǎn)物可以先被分離出再進行下一步反應(yīng)，因此他們能夠合成兩種不同單體形成的異源二聚體。
經(jīng)過對多種同源二聚體和異源二聚體進行凝膠遷移實驗分析，他們發(fā)現(xiàn)Myc-Myc以及OmoMyc-OmoMyc均沒有結(jié)合DNA的能力，剩余幾種二聚體的結(jié)合能力各有不同，其中Max-Max的結(jié)合能力最強，為50 ± 11 nM，說明他們合成的穩(wěn)定共價鍵連接的Max-Max能夠作為有效的Myc拮抗劑。此外，他們合成的Max-Max在PBS以及血清中均具有一定的穩(wěn)定性，能夠用于活細胞水平上的研究。
考慮到二聚化的Max具有兩個帶正電的N端loop結(jié)構(gòu)，作者推測Max-Max具有一定的跨膜能力，通過對標(biāo)記有熒光的Max-Max進行共聚焦成像，他們發(fā)現(xiàn)在Hela細胞內(nèi)隨著加入蛋白濃度的提高出現(xiàn)了對應(yīng)的熒光信號上升，說明Max-Max本身具有跨膜能力。為了測試進入細胞的Max-Max能否作為Myc的拮抗劑進而抑制細胞增殖，作者在Hela，A549，H441三種細胞系上測試了Max-Max的活性，發(fā)現(xiàn)在Myc水平較高的Hela中EC50為6μM，而在Myc水平較低的另外兩種細胞中EC50為19μM，這也與Max-Max抑制Myc通路來抑制增殖是吻合的。
總之，這篇文章利用鈀氧化加成復(fù)合物合成了以穩(wěn)定共價鍵連接的Max和Myc轉(zhuǎn)錄因子的多種同源/異源二聚體，并發(fā)現(xiàn)Max-Max可作為有效的Myc拮抗劑。
本文作者：LDY
責(zé)任編輯：LYP
原文鏈接：https://pubs.acs.org/doi/10.1021/jacs.1c05666
原文引用：DOI：10.1021/jacs.1c05666
