日韩不卡在线观看视频不卡,国产亚洲人成A在线V网站,处破女八a片60钟粉嫩,日日噜噜夜夜狠狠va视频

通過生物正交反應(yīng)對蛋白質(zhì)進(jìn)行共價(jià)修飾對于許多生物學(xué)研究和基于蛋白質(zhì)療法的開發(fā)至關(guān)重要。生成蛋白質(zhì)偶聯(lián)物的常用方法包括代謝標(biāo)記、基于活性的標(biāo)記、目標(biāo)蛋白質(zhì)與酶或肽標(biāo)簽的融合和非天然氨基酸摻入等。生物環(huán)境中對天然蛋白質(zhì)進(jìn)行特定的共價(jià)修飾一直具有挑戰(zhàn)性。小分子共價(jià)配體與非共價(jià)配體相比具有多項(xiàng)優(yōu)勢，包括能夠以相似的親和力、較低濃度的劑量以及與蛋白質(zhì)相匹配的作用持續(xù)與內(nèi)源性配體競爭。但是，單個(gè)核苷酸的化學(xué)修飾不太可能消除它們的結(jié)合親和力。而小分子抑制劑通常無法適應(yīng)這種變化。適體在蛋白質(zhì)結(jié)合方面的廣泛范圍以強(qiáng)大的方式補(bǔ)充了可轉(zhuǎn)移合成基序提供的功能。適體在大表面積上與其蛋白質(zhì)靶標(biāo)相互作用。此外，寡核苷酸是通過自動化化學(xué)合成產(chǎn)生的，因此很容易獲得。

近期，來自匹茲堡大學(xué)化學(xué)系的Prof.?Dr. Alexander Deiters課題組在《Angew. Chem. Int. Ed.》上發(fā)表了一篇題為“Protein Labeling and Crosslinking by Covalent Aptamers”的文章。文章中開發(fā)了一種使用親電共價(jià)適體在其生物環(huán)境中選擇性修飾天然蛋白質(zhì)的新方法。這些適體是通過在特定核苷酸位點(diǎn)引入接近驅(qū)動的親電子試劑而產(chǎn)生的。使用凝血酶作為概念驗(yàn)證，作者證明了共價(jià)適體可以選擇性地轉(zhuǎn)移各種功能手柄，或不可逆地交聯(lián)到目標(biāo)蛋白。這種方法提供了廣泛的可編程性和高目標(biāo)特異性。此外，它解決了適體常見的問題，例如對內(nèi)源性核酸酶的不穩(wěn)定性和在目標(biāo)參與期間的停留時(shí)間。共價(jià)適體是實(shí)現(xiàn)特定蛋白質(zhì)修飾和靈敏蛋白質(zhì)檢測的新工具。此外，它們提供延長的、抗核酸酶的酶抑制作用。

圖文解讀

圖1. 處理轉(zhuǎn)移核酸配體的一般方案。適體將其結(jié)合的功能標(biāo)記和可切割的親電子試劑引導(dǎo)至目標(biāo)蛋白質(zhì)。親核殘基與適體結(jié)合的親電試劑快速反應(yīng)，導(dǎo)致手柄不可逆地轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上。

圖2. 用親電試劑 A) 1或 B)? 2修飾的具有特定胸腺嘧啶的單個(gè)適體?分別與凝血酶孵育 4 小時(shí)和 1 小時(shí)，并通過蛋白質(zhì)印跡分析生物素化效率。T13和T3修飾的適體分別顯示出最有效的標(biāo)記轉(zhuǎn)移到蛋白質(zhì)上。

圖3. A) 與凝血酶（粉紅色）復(fù)合的TBA（藍(lán)色）的晶體結(jié)構(gòu)。放大的圖像顯示，基于質(zhì)譜測序，T3 靠近標(biāo)記的賴氨酸（綠色），遠(yuǎn)離未標(biāo)記的賴氨酸（黃色）。晶體結(jié)構(gòu)中缺少一種生物素化賴氨酸K149。TBA(3)- 2通過質(zhì)譜測序確定，當(dāng)與凝血酶一起孵育時(shí)，19種賴氨酸中僅5種被生物素化。這些賴氨酸位于適體-蛋白質(zhì)結(jié)合界面，基于 TBA-凝血酶晶體結(jié)構(gòu)。B) 突出顯示生物素化賴氨酸（綠色）和未修飾賴氨酸（紅色）的標(biāo)記產(chǎn)量的圖表。質(zhì)譜未涵蓋的肽以灰色顯示。生物素化百分比表示在指定的 Lys 殘基處生物素化的凝血酶分子的分?jǐn)?shù)。定量顯示K149、K109-110和K36分別被91%、74%和4% 生物素化，從而證明了手柄轉(zhuǎn)移適體的位點(diǎn)選擇性。

圖4. A) 在過量BSA (1.5 μM) 存在下的凝血酶 (300 nM) 標(biāo)記選擇性實(shí)驗(yàn)。凝血酶 (300 nM) 在過量BSA (1.5 μM) 存在的情況下被完全生物素化。B) 人血漿中的凝血酶 (300 nM) 選擇性實(shí)驗(yàn)。使用的TBA(3)-2的濃度為0、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。凝血酶和TBA(3)- 2在人血漿中孵育（≈1.5 mM 總蛋白質(zhì)濃度），再次觀察到高效的靶標(biāo)標(biāo)記，而沒有其他蛋白質(zhì)在高達(dá)500 nM的適體濃度下被生物素化。C) 凝血酶生物素化時(shí)程實(shí)驗(yàn)。凝血酶的濃度維持在300 nM。時(shí)間過程實(shí)驗(yàn)表明，凝血酶的共價(jià)修飾不僅具有選擇性，而且速度很快，在1 μM 和0.5 μM TBA(3) -2時(shí)，t _1/2 分別為9.6分鐘和34分鐘。

圖5. 在變性凝膠上分析熒光手柄轉(zhuǎn)移。A) DEACM N-?；酋０酚H電結(jié)構(gòu)。B) 與使用未結(jié)合親電試劑的非選擇性標(biāo)記相比，在存在過量 BSA (1.5 μM) 的情況下，使用結(jié)合物選擇性處理轉(zhuǎn)移到 300 nM 凝血酶。C) 選擇性處理轉(zhuǎn)移到人血漿中的凝血酶 (300 nM)。使用的TBA(3) -3的濃度為0.03、0.06、0.12、0.25、0.5和1 μM。

圖6. A) 使用倒置親電試劑進(jìn)行適體-蛋白質(zhì)交聯(lián)。B) 濃度依賴性適體-蛋白質(zhì)交聯(lián)（300 nM的凝血酶）。C) 在人血漿中的選擇性實(shí)驗(yàn)。再次顯示在適配體濃度高達(dá) 500 nM（37°C 下1小時(shí)）時(shí)選擇性靶向交聯(lián)，與之前的結(jié)果（生物素遞送適配體）相匹配。D) 時(shí)間進(jìn)程生物素化實(shí)驗(yàn)（300 nM的凝血酶）。E) TBA-4 (1 μM) 與凝血酶 (300 nM) 的位置依賴性交聯(lián)。表明交聯(lián)位置依賴性與生物素化的位置依賴性相似，因此表明彈頭可以很容易地從標(biāo)記轉(zhuǎn)移到交聯(lián)互換。F) 使用500 nM 凝血酶的纖維蛋白原凝血測定。添加纖維蛋白原并在 30分鐘內(nèi)記錄吸光度，然后外推凝血時(shí)間。與未修改的TBA相比，TBA(3)-4導(dǎo)致凝血時(shí)間延長2倍，表明可以通過共價(jià)交聯(lián)增強(qiáng)適體的效力。

總結(jié)展望

總之，文章開發(fā)了一種能夠快速和選擇性地進(jìn)行蛋白質(zhì)共價(jià)標(biāo)記的適體；它將生物素和熒光團(tuán)等功能基序轉(zhuǎn)移到緩沖液和人血漿中的天然凝血酶中。標(biāo)記具有完全的蛋白質(zhì)特異性和完全的賴氨酸化學(xué)選擇性。交聯(lián)親電彈頭的反轉(zhuǎn)能夠快速形成蛋白質(zhì)-寡核苷酸偶聯(lián)物，每個(gè)蛋白質(zhì)僅結(jié)合一個(gè)適體。共價(jià)適體比其非共價(jià)對應(yīng)物更有效地抑制凝血酶的酶促功能。此外，標(biāo)記發(fā)生在超過內(nèi)源性核酸酶降解的時(shí)間尺度上，和交聯(lián)適體對核酸酶介導(dǎo)的降解保持免疫超過 24小時(shí)。其使用非常簡單的蛋白質(zhì)印跡、熒光和放射照相協(xié)議，三種傳遞的化學(xué)基序中的每一種都實(shí)現(xiàn)了一種獨(dú)特的蛋白質(zhì)檢測方法，濃度在皮至納摩爾范圍內(nèi)。作者希望這里介紹的方法廣泛適用于現(xiàn)有和未來的適配體，并且它能夠使這一類重要的基于核酸的探針在蛋白質(zhì)的修飾、檢測和抑制方面有新的應(yīng)用。

文獻(xiàn)鏈接

https://doi.org/10.1002/anie.202101174

作者簡介

Alexander Deiters

匹茲堡大學(xué)

研究方向：

化學(xué)生物學(xué)、化學(xué)遺傳學(xué)、合成化學(xué)、合成生物學(xué)、光化學(xué)；生物活性小分子—合成和方法開發(fā)；通過細(xì)胞通路的小分子靶向藥物發(fā)現(xiàn)；用于研究生物過程的光化學(xué)工具。

獲獎情況：

北卡羅來納州立大學(xué) - 校友會杰出研究獎 (2011)

美國癌癥協(xié)會 - 研究學(xué)者獎 (2011)

Thieme 化學(xué)期刊獎（2010 年）

美國化學(xué)學(xué)會 - Teva 美國學(xué)者獎（2009 年）

編輯：陳汝

審核：張?zhí)煲?/span>

推送：龔波